1. Алғашқы түсінік

Бұл кезеңде біз үлкендер алдында қателіктер жібермеу үшін кейбір ұғымдар мен терминологияларды түсінуіміз керек, мысалы:

Сұрақ: RT-PCR, qPCR, Real-time PCR және нақты уақыттағы RT-PCR арасындағы айырмашылық неде?

Жауап: RT-ПТР кері транскрипциялық ПТР(кері транскрипциялық ПТР, RT-ПТР), бұл полимеразды тізбекті реакцияның (ПТР) кеңінен қолданылатын нұсқасы.RT-ПТР кезінде РНҚ тізбегі қосымша ДНҚ-ға кері транскрипцияланады, содан кейін ол ПТР арқылы ДНҚ күшейту үшін үлгі ретінде пайдаланылады.
Нақты уақыттағы ПТР және qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) бірдей нәрсе, екеуі де нақты уақыттағы сандық ПТР, яғни ПТР-ның әрбір циклінде нақты уақыттағы деректер жазбалары бар, сондықтан бастапқы үлгілердің санын дәл талдауды реттеуге болады.

Нақты уақыттағы ПТР (нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР) және кері транскрипциялық ПТР (кері транскрипциялық ПТР) екеуі де RT-PCR ретінде қысқартылған болып көрінсе де, халықаралық конвенция: RT-PCR кері транскрипцияға қатысты.ПТР , Нақты уақыттағы ПТР әдетте qPCR (сандық нақты уақыттағы ПТР) ретінде қысқартылған..

Ал нақты уақыттағы RT-PCR (RT-qPCR), бұл флуоресцентті сандық технологиямен біріктірілген кері транскрипциялық ПТР.: алдымен РНҚ кері транскрипциясынан cDNA (RT) алыңыз, содан кейін сандық талдау (qPCR) үшін нақты уақыттағы ПТР пайдаланыңыз.Көптеген зертханалар RT-qPCR, яғни РНҚ экспрессиясының төмендеуін реттеу бойынша зерттеулер жүргізеді, сондықтан зертханада барлығы айтатын qPCR шын мәнінде RT-qPCR-ге жатады, бірақ клиникалық қолданбаларда әлі де көптеген ДНҚ сынақтары бар екенін ұмытпаңыз.В гепатиті вирусын HBV анықтау сияқты сандық талдау.

Сұрақ: Флуоресцентті сандық ПТР көп оқығаннан кейін, неліктен күшейтілген фрагментті 80-300bp диапазонында бақылау керек?

Жауап: Әрбір ген тізбегінің ұзындығы әртүрлі, кейбіреулері бірнеше кб, кейбіреулері жүздеген бит, бірақ праймерлерді жобалау кезінде өнімнің ұзындығын тек 80-300 бит талап етуіміз керек, тым қысқа немесе тым ұзын флуоресцентті сандық ПТР анықтауға жарамайды.Өнімнің фрагменті праймер-димерден ажырату үшін тым қысқа.Праймер-димердің ұзындығы шамамен 30-40bp, және ол 80bp-ден аз болса, оның праймер-димер немесе өнім екенін ажырату қиын.Егер өнім фрагменті тым ұзын болса, 300 бит-тен асса, ол күшейтудің төмен тиімділігіне оңай әкеледі және геннің мөлшерін тиімді анықтай алмайды.

Мысалы, сыныпта қанша адам бар екенін санағанда, тек қанша ауыз бар екенін санау керек.Сіз гендерді анықтаған кезде де дәл солай болады, сізге тек геннің белгілі бір тізбегін көрсету үшін бүкіл тізбек орындалады.Адамдарды санағың келсе, ауыз бен мұрынды, құлақты, көзілдірікті де санау керек, қателесу оңай.

Кеңейту үшін, биологиялық зерттеулерде нүктеден аймаққа көптеген зерттеу жағдайлары бар, өйткені кез келген түрдің гендік тізбегі өте ұзақ, барлық фрагменттерді өлшеу қажет емес және мүмкін емес, мысалы, бактериялық 16S секвенциясы, бұл бактериялардың консервативті тізбегін жүзеге асыру болып табылады.

Q: qPCR праймер дизайны үшін оңтайлы ұзындық қандай?

Жауап: Жалпы айтқанда, праймердің ұзындығы шамамен 20-24б., бұл жақсырақ.Әрине, праймерді жобалау кезінде біз праймердің ТМ мәніне назар аударуымыз керек, өйткені бұл оңтайлы күйдіру температурасына қатысты.Көптеген тәжірибелерден кейін 60°C жақсырақ ТМ мәні екені дәлелденді.Егер жасыту температурасы тым төмен болса, ол спецификалық емес күшейтуге оңай әкеледі.Егер жасыту температурасы тым жоғары болса, күшейту тиімділігі салыстырмалы түрде төмен болады, күшейту қисығының шыңы кейінірек басталады және КТ мәні кешіктіріледі.

С: Бояу әдісі зонд әдісінен несімен ерекшеленеді?

Жауабы: Бояу әдісіКейбір флуоресцентті бояғыштар, мысалы, SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO және т.б., өздігінен жарық шығармайды, бірақ қос тізбекті ДНҚ-ның кіші ойығымен байланысқаннан кейін флуоресценция шығарады.Сондықтан ПТР реакциясының басында құрылғы флуоресцентті сигналды анықтай алмайды.Реакция жасыту-кеңейту сатысына жеткенде қос тізбек ашылып, ДНҚ-полимеразаның әсерінен жаңа тізбек синтезделеді де, флуоресцентті молекула dsDNA кіші ойығымен байланысады.ПТР циклдерінің саны артқан сайын, көбірек бояғыштар қос тізбекті ДНҚ-мен біріктіріледі және флуоресцентті сигнал да үздіксіз күшейтіледі.Бояу әдісі негізінен ғылыми зерттеулерде қолданылады.
PS: Тәжірибе жасағанда абай болыңыз, бояғыш адамның ДНҚ-сымен біріктірілуі керек, оны флуоресцентті адамға айналдыру үшін абай болыңыз.

Бояу әдісі (сол жақта) зонд әдісі (оң жақта)
PS: Тәжірибе жасағанда абай болыңыз, бояғыш адамның ДНҚ-сымен біріктірілуі керек, оны флуоресцентті адамға айналдыру үшін абай болыңыз.

SYBR Green Ⅰ ДНҚ-ның кіші ойығымен байланысады

Зонд әдісіТакман зонды ең жиі қолданылатын гидролиздік зонд болып табылады.Зондтың 5′ ұшында флуоресцентті топ бар, әдетте FAM, және зондтың өзі мақсатты генге қосымша реттілік болып табылады.3′ ұшында флуоресцентті сөндіру тобы бар.Флуоресцентті резонанстық энергияның берілу принципіне сәйкес (Förster резонансты энергияның ауысуы, FRET), репортер флуоресцентті топ (донорлық флуоресцентті молекула) және сөндіргіш флуоресцентті топ (акцепторлы флуоресцентті молекула) қоздырылғанда. акцепторлы молекула, ал автофлуоресценция әлсіреген.Сондықтан, ПТР реакциясының басында зонд жүйеде бос және бүтін болғанда, репортер флуоресцентті топ флуоресценцияны шығармайды.Жасыту кезінде праймер мен зонд үлгіге байланады.Кеңейту кезеңінде полимераза үздіксіз жаңа тізбектерді синтездейді.ДНҚ-полимераза 5′-3′ экзонуклеаза белсенділігіне ие.Зондқа жеткенде, ДНҚ полимераза үлгідегі зондты гидролиздейді, репортер флуоресценттік тобын сөндіруші флуоресценттік топтан бөліп, флуоресцентті сигналды шығарады.Зонд пен шаблон арасында бір-бірлік байланыс болғандықтан, сынақтың дәлдігі мен сезімталдығы бойынша зонд әдісі бояу әдісінен жоғары.Диагностикада негізінен зонд әдісі қолданылады.

С: Абсолютті сандық көрсеткіш дегеніміз не?Салыстырмалы мөлшерлеу дегеніміз не?

Жауап: Абсолютті сандық анықтау qPCR арқылы сыналатын үлгінің бастапқы көшірме нөмірін, мысалы, 1 мл қанда қанша HBV вирусы бар екенін есептеуді білдіреді.Салыстырмалы сандық анықтау арқылы алынған нәтиже басқа анықтамалық үлгіге қатысты нақты үлгідегі мақсатты ген мөлшерінің өзгеруі болып табылады және ген экспрессиясы жоғары немесе төмен реттеледі.

С: РНҚ экстракциясының мөлшері, кері транскрипция тиімділігі және күшейту тиімділігі эксперимент нәтижелеріне әсер ете ме?
С: Үлгіні сақтау, экстракция реагенттері, кері транскрипция реагенттері және жарық өткізетін шығын материалдары эксперимент нәтижелеріне әсер ете ме?
С: Эксперименттік деректерді қандай әдіспен түзетуге болады?

Осы мәселелерге қатысты біз оларды төменде кеңейтілген және кеңейтілген бөлімдерде егжей-тегжейлі сипаттайтын боламыз.
2. Жетілдірілген білім

Нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР-ға келетін болсақ, біз жыл сайын мыңдаған ғылыми зерттеулердің жарияланатынын, олардың арасында флуоресцентті сандық ПТР технологиясы аз емес екенін мойындауымыз керек.

Флуоресцентті сандық ПТР тәжірибесін өлшеудің ортақ стандарты болмаса, нәтижелер әртүрлі болуы мүмкін.Бір түрдің бір гені үшін бірдей өңдеу әдісімен анықтау нәтижелері де кең көлемде өзгереді және кеш келгендерге бірдей нәтижелерді қайталау қиын болады.Сіз қайсысы дұрыс, қайсысы бұрыс екенін ешкім білмейді.

Бұл флуоресцентті сандық ПТР алдамшы технология немесе сенімсіз технология екенін білдіре ме?Жоқ, себебі флуоресцентті сандық ПТР сезімтал және дәлірек, ал сәл қате операция мүлдем қарама-қарсы нәтиже береді.Кішкене шығын мың миль қашықтықта.Мақала авторы рецензенттер тарапынан қайта-қайта азапталуы мүмкін.Сонымен қатар, журналдың рецензенттері де әртүрлі эксперименттік нәтижелерден таңдау қиын.

Тұтастай алғанда, нақты уақыттағы ПТР эксперименттерінде консенсустың жоқтығын көрсетеді.Осы мақсатта саланың аға ғалымдары стандарттарды тұжырымдай бастады,салымшылардан осы стандарттарға сай болу үшін мақалада кейбір қажетті эксперименттік және деректерді өңдеу мәліметтерін (қажетті деректерді қоса) қамтамасыз етуді талап етеді.

Рецензенттер осы мәліметтерді оқу арқылы эксперименттің сапасын бағалай алады;болашақ оқырмандар мұны экспериментті қайталау немесе экспериментті жақсарту үшін де пайдалана алады.Сонда осылайша алынған эксперименттік нәтижелер ақпаратқа толы, сапалы, қолдануға жарамды.

MIBBI (Биологиялық және биомедициналық зерттеулерге арналған минималды ақпарат -http://www.mibbi.org) пайда болды.MIBBI – эксперименттер үшін стандарттарды қамтамасыз ететін жоба.Ол табиғатта жарияланады.Бұл жоба әртүрлі биологиялық эксперименттерге бағытталған, соның ішінде жасуша биологиясы, Microarray, qPCR, біз қазір талқылаймыз және т.б. және қолжазбаларды тапсыру кезінде эксперименттің әрбір түрін қарастырады.Бұл ақпарат әрқашан берілуі керек.

MIBBI жобасында флуоресцентті сандық ПТР-ға қатысты екі мақала бар, атап айтқанда:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – нақты уақыттағы сандық ПТР деректері үшін құрылымдық тіл және есеп беру нұсқаулығы;
·MIQE (сандық нақты уақыттағы ПТР эксперименттерін жариялау үшін ең аз ақпарат) – нақты уақыттағы сандық ПТР эксперименттері туралы мақалаларды жариялау үшін ең аз ақпарат.
Алдымен RDML, терминология спецификациясы туралы сөйлесейік.

Барлығына стандартты анықтама болмаса, талқылауды жалғастыру мүмкін емес, сондықтан емтиханда терминдерді түсіндіру өте маңызды.
Флуоресценттік сандық ПТР экспериментінде қолданылатын терминология келесі мазмұнды қамтиды.QIAGEN біз үшін ең жақсы қорытындыны жасады.Төмендегілердің барлығы құрғақтауарлар .

Күшейту қисығы
Күшейту қисығы ПТР процесі кезінде жасалған қисыққа жатады, цикл нөмірі абсцисса ретінде және реакция кезінде нақты уақыттағы флуоресценция қарқындылығы ордината ретінде.

Керемет күшейту қисығы келесі сипаттамаларға ие болуы керек: базалық сызық тегіс немесе сәл төмендеген және айқын жоғарылау үрдісі жоқ;қисықтың иілу нүктесі анық, ал экспоненциалды фазаның еңісі күшейту тиімділігіне пропорционал.Еңіс неғұрлым үлкен болса, күшейту тиімділігі соғұрлым жоғары болады;жалпы күшейту қисығы Параллелизм жақсы, бұл әрбір түтіктің күшейту тиімділігінің ұқсас екенін көрсетеді;төмен концентрациялы үлгілердің күшейту қисығының экспоненциалды фазасы айқын.

Базалық (базалық)
Базалық деңгей - ерте циклдің шу деңгейі, әдетте 3-ші және 15-ші цикл арасында өлшенеді, себебі күшейту өнімі тудыратын флуоресценция мәнінің жоғарылауын осы кезеңде анықтау мүмкін емес.Базалық сызықты есептеу үшін пайдаланылатын циклдар саны әртүрлі болуы мүмкін және жоғары үлгі сомалары пайдаланылса немесе мақсатты геннің экспрессия деңгейі жоғары болса, оларды азайту қажет болуы мүмкін.

Негізгі сызықты орнату сызықтық күшейту қисығынан флуоресценция деректерін қарауды талап етеді.Негізгі сызық күшейту қисығының өсуі бастапқы циклдің жоғарғы санынан үлкен цикл санынан басталатындай етіп орнатылады.Базалық сызықтарды әрбір мақсатты реттілік үшін жеке орнату қажет.Ерте циклдерде анықталған флуоресценцияның орташа мәндерін күшейтілген өнімдерде алынған флуоресценция мәндерінен алып тастау қажет.Әртүрлі нақты уақыттағы ПТР бағдарламалық құралының соңғы нұсқалары жеке үлгілер үшін бастапқы параметрлерді автоматты түрде оңтайландыруға мүмкіндік береді.

ПТР күшейту реакциясының алғашқы бірнеше циклында флуоресценция сигналы көп өзгермейді.Түзу сызыққа жақындау негізгі сызық деп аталады, бірақ егер біз алғашқы бірнеше циклды мұқият қарастырсақ, төмендегі суретте не болып жатқанын негізгі сызықтың ішінде көреміз.

Фондық фон мынаны білдіреді
реакциядағы спецификалық емес флуоресценция мәні .Мысалы: тиімсіз флуоресценцияны сөндіру;немесе SYBR Green қолдануына байланысты қос тізбекті ДНҚ үлгілерінің үлкен саны.Сигналдың фондық құрамдас бөліктері Real-Time ПТР бағдарламалық қамтамасыз ету алгоритмі арқылы математикалық түрде жойылады.

Репортер сигналы
Репортер сигналы нақты уақыттағы ПТР кезінде SYBR Green немесе флуоресцентті таңбаланған дәйектілікке тән зондтармен жасалған флуоресцентті сигналға жатады.

Нормаланған репортер сигналы (RN)
RN репортер бояуының флуоресценция қарқындылығын әрбір циклде өлшенген пассивті анықтамалық бояудың флуоресценция қарқындылығына бөледі.

Пассивті анықтамалық бояу
Кейбір нақты уақыттағы ПТР-да,флуоресцентті бояғыш ROX флуоресцентті сигналды қалыпқа келтіру үшін ішкі сілтеме ретінде пайдаланылады.Ол дұрыс емес тамшуырға, ұңғыманың орналасуына және флуоресценция ауытқуларына байланысты ұңғыма негізіндегі өзгерістерді түзетеді.

Флуоресценция шегі (табалдырық)
фондық мәннен жоғары және күшейту қисығының үстірт мәнінен айтарлықтай төмен реттелді.Ол ПТР анықтаудың лог-сызықты диапазонын білдіретін күшейту қисығының сызықтық аймағында орналасуы керек.ПТР лог-сызықты фазасы оңай анықталатындай етіп лог-күшейту қисығы көрінісінде шекті мәндер орнатылуы керек.Нақты уақыттағы ПТР-де бірнеше мақсатты гендер болса, шекті әрбір мақсат үшін орнату керек.Әдетте, флуоресценциялық фон сигналы ретінде ПТР реакциясының алғашқы 15 циклінің флуоресценциялық сигналы пайдаланылады, ал флуоресценция шегі ПТР алғашқы 3-15 циклінің флуоресценция сигналының стандартты ауытқуынан 10 есе көп, ал флуоресценция шегі ПТР амплонификация фазасында орнатылады.Жалпы, әрбір құралдың флуоресценция шегін қолданар алдында орнатылған.

Цикл шегі (CT) немесе қиылысу нүктесі (CP)
Күшейту қисығы табалдырықты кесіп өтетін цикл (яғни, флуоресценцияны анықтау айтарлықтай өсетін нүкте).КТ бөлшек болуы мүмкін және бастапқы үлгінің мөлшерін есептеуге болады.CT мәні әрбір ПТР реакция түтігіндегі флуоресцентті сигнал белгіленген шекке жеткенде орын алған циклдар санын білдіреді.Әрбір үлгінің CT мәні мен шаблонның бастапқы көшірме нөмірі логарифмінің арасында сызықтық байланыс бар.бастапқы көшірме саны неғұрлым жоғары болса, CT мәні соғұрлым аз болады және керісінше.Стандартты қисық бастапқы көшірме нөмірі белгілі стандартты пайдалану арқылы жасалуы мүмкін, мұнда абсцисса CT мәнін, ал ордината бастапқы көшірме санының логарифмін білдіреді.Сондықтан белгісіз үлгінің CT мәні алынғанша, үлгінің бастапқы көшірме нөмірін стандартты қисық сызықтан есептеуге болады.

ΔCT мәні
ΔCT мәні сипаттайдымақсатты ген мен сәйкес эндогендік анықтамалық геннің CT мәні арасындағы айырмашылық, мысалы, шаруашылық гені және пайдаланылатын үлгінің мөлшерін қалыпқа келтіру үшін пайдаланылады:
⇒ΔCT = CT (мақсатты ген) – CT (эндогенді анықтамалық ген)

ΔΔCT мәні
ΔΔCT мәні қызықтыратын үлгінің (мысалы, ынталандырылған ұяшықтар) орташа ΔΔCT мәні мен анықтамалық үлгінің орташа ΔΔCT мәні (мысалы, ынталандырылмаған ұяшықтар) арасындағы айырмашылықты сипаттайды.Анықтамалық үлгі калибрлеу үлгісі деп те аталады және барлық басқа үлгілер салыстырмалы сандық анықтау үшін осыған нормаланады:
⇒ΔΔCT = орташа ΔCT (қызығушылық үлгісі) – орташа ΔCT (анықтамалық үлгі)

Эндогенді анықтамалық гендер (эндогенді референт гендер)
Эндогендік референттік гендердің экспрессия деңгейлері, мысалы, шаруашылық гендері (тұрмыстық гендер) үлгілер арасында ерекшеленбейді.Анықтамалық геннің CT мәндерін мақсатты генмен салыстыру мақсатты геннің экспрессия деңгейін кіріс РНҚ немесе cDNA мөлшеріне қалыпқа келтіруге мүмкіндік береді (жоғарыдағы ΔCT мәндері туралы бөлімді қараңыз).

Ішкі анықтамалық гендер үшін дұрысықтимал РНҚ деградациясы немесе РНҚ үлгілерінде фермент ингибиторларының болуы, сондай-ақ РНҚ мазмұнының өзгеруі, кері транскрипция тиімділігі, нуклеин қышқылының қалпына келуі және үлгіні өңдеу.Оңтайлы анықтамалық ген(дер)ді таңдау үшін біз алгоритмді эксперименттік параметрге байланысты оңтайлы анықтаманы таңдауға мүмкіндік беретіндей өзгерттік.

Ішкі бақылау
Мақсатты реттілікпен бірдей реакцияда күшейтілетін және басқа зондпен зерттелетін басқару тізбегі (яғни, дуплексті ПТР орындау).Ішкі басқару элементтері мақсатты реттілік анықталмаған кездегі сияқты сәтсіз күшейтуді болдырмау үшін жиі пайдаланылады.
Калибрлеу үлгісі
Геннің салыстырмалы экспрессия деңгейін анықтау үшін барлық басқа үлгілерді салыстыру үшін салыстырмалы сандық анықтауда қолданылатын анықтамалық үлгі (мысалы, жасуша сызығынан немесе тіннен тазартылған РНҚ).Калибрлеу үлгісі кез келген үлгі болуы мүмкін, бірақ әдетте бақылау болып табылады (мысалы, өңделмеген үлгі немесе эксперименттің нөл уақытындағы үлгі).

Оң басқару элементтері
бақылау реакцияларын қолданадыүлгінің белгілі көлемі.Оң басқару элементтері праймер жинағының немесе праймер-зонд жинағының дұрыс жұмыс істеп тұрғанын және реакцияның дұрыс орнатылғанын тексеру үшін жиі пайдаланылады.

Үлгіні басқару жоқ (NTC)
Әдетте сумен ауыстырылатын шаблоннан басқа күшейту реакциясының барлық қажетті компоненттерін қамтитын бақылау реакциясы.NTC пайдалану реагенттің ластануынан немесе бөгде ДНҚ-дан туындаған ластануды таба алады, осылайша анықтау деректерінің шынайылығы мен сенімділігін қамтамасыз етеді.NTC бақылауының күшейтілуі ластануды көрсетеді.

RT бақылауы жоқ (NRT)
РНҚ экстракция процесінде қалдық геномдық ДНҚ болуы мүмкін, ол өте зиянды және деректер сапасына әсер ететін кінәлі және qPCR табиғи жауы болып табылады, сондықтан эксперименттерді құрастырған кезде ол тек РНҚ анықтауын күшейтуге арналған болуы керек.Екі жол бар, бірі - интрондар арқылы праймерлерді жобалау, екіншісі - ДНҚ-ны толығымен жою, қайсысы жақсы, ол кейінірек талқыланады.NTR бақылауы - бұл ДНҚ ластануын анықтауға арналған сиқырлы айна.Егер күшейту болса, бұл ластану бар дегенді білдіреді.

Стандарттар
Стандарттар - стандартты қисық сызықты құру үшін пайдаланылатын белгілі концентрацияның үлгілері немесе көшірме саны.Стандарттың тұрақтылығын қамтамасыз ету үшін ген фрагменті әдетте плазмидаға клондалады және стандарт ретінде пайдаланылады.

Стандартты қисық
әдетте екі еселеу коэффициентіне сәйкес стандартты өніммен кем дегенде 5 концентрация градиентіне сұйылтылады және CT мәні мен көшірме нөмірі координатасында 5 нүкте сызылады және стандартты қисық генерациялау үшін сызықты қалыптастыру үшін нүктелер қосылады.Әрбір стандартты қисық үшін оның жарамдылығын тексеру қажет.Көлбеу мәні –3,3 және –3,8 аралығында болады және әрбір концентрация үш рет орындалады.Басқа нүктелерден айтарлықтай ерекшеленетін нүктелерді алып тастау керек.Сыналатын үлгінің CT мәні стандартты қисыққа келтіріліп, сыналатын үлгінің өрнек деңгейін есептеуге болады.

Сыналатын үлгінің CT мәні стандартты қисыққа келтіріледі және сыналатын үлгінің бастапқы көшірме нөмірін есептеуге болады.

Тиімділік және көлбеулік
Стандартты қисықтың еңісі нақты уақыттағы ПТР тиімділігін көрсетеді.
·Көлбеу -3,322 ПТР күшейту тиімділігінің 1 немесе 100% тиімді екенін және әр циклде ПТР өнімінің мөлшері екі есе өсетінін көрсетеді.
· –3,322 (мысалы, –3,8) төмен көлбеу ПТР тиімділігін көрсетеді
· –3,322-ден (мысалы, –3,0) үлкен көлбеу ПТР тиімділігі 100%-дан жоғары болып көрінетінін көрсетеді, бұл қызық, ПТР бір циклі күшейтілген өнімді екі еседен артық қалай жасай алады?Бұл жағдай ПТР реакциясының сызықты емес фазасында орын алады, яғни спецификалық емес күшейтудің көп мөлшері болады.

балқу қисығы
qPCR күшейту аяқталғаннан кейін ПТР өнімі қызады.Температура көтерілген сайын қос тізбекті күшейту өнімі бірте-бірте еріп, флуоресценция қарқындылығының төмендеуіне әкеледі.Белгілі бір температураға (Тм) жеткенде өнімдердің көп мөлшері еріп кетеді.Флуоресценция күрт төмендейді.Әртүрлі ПТР өнімдерінің әртүрлі Tm мәндері және әртүрлі балқу температурасы бар, сондықтан ПТР ерекшелігін анықтауға болады.

Балқу қисығы (туынды қисық)
Балқу қисығы ПТР өнімінің фрагменттерінің жағдайын интуитивті түрде көрсете алатын шың картасын қалыптастыру үшін алынған.Балқу температурасы ДНҚ фрагментінің Tm мәні болғандықтан, ДНҚ фрагментінің Tm мәніне әсер ететін кейбір параметрлерді, мысалы, фрагмент өлшемі, GC мазмұны және т.б. бағалауға болады. Жалпы айтқанда, біздің праймерді жобалау принциптеріне сәйкес,күшейтілген өнімнің ұзындығы 80-300bp диапазонында, сондықтан балқу температурасы 80 ° C пен 90 ° C аралығында болуы керек.

Балқу қисығының интерпретациясы: Жалғыз негізгі шыңы 80°C-90°C аралығында пайда болса, бұл флуоресцентті сандық ПТР тамаша екенін білдіреді;егер негізгі шыңы 80°C-90°C аралығында болса және әр түрлі шыңдар 80°C төмен болса, онда праймер димері негізінен қарастырылады.Оны шешу үшін жасыту температурасын жоғарылатуға болады;егер негізгі шыңы 80°С-90°С аралығында пайда болса, ал әр түрлі шыңы температура көтерілген кезде қайтадан пайда болса, негізінен ДНҚ-ның ластануы бар деп есептелінеді және тәжірибенің бастапқы кезеңінде ДНҚ-ны жою қажет.

Әрине, әлі де кейбір қалыптан тыс жағдайлар бар, олар төменде бір-бірлеп бөлінеді.
3. Жетілдірілген білім

qPCR жасау үшін мен MIQE деп айтуым керек,Ең аз ақпаратжариялау үшінСандықНақты уақыттағы ПТРЭксперименттер — нақты уақыттағы сандық ПТР туралы мақалаларды жариялау үшін ең аз ақпаратэксперименттер.Барлығының түсінігін жеңілдету үшін біз негізгі мазмұнды жеңілдетеміз.

Интернетте MIQE түпнұсқа мәтінін іздеуге болады, ең бастысы, ондамақаланы жариялау кезінде ұсынылуы қажет деректерді тексеру тізімі .

Рецензенттер осы мәліметтерді оқу арқылы эксперименттің сапасын бағалай алады;болашақ оқырмандар мұны тәжірибені қайталау немесе жақсарту үшін де пайдалана алады.
Бұл тізімде әрбір тізімнің маңыздылығы тиісінше E немесе D әрпімен белгіленгенін атап өткен жөн.Ол нені білдіреді?E: маңызды ақпарат (тапсыру керек);D: қажет ақпарат (мүмкіндігінше қамтамасыз ету).

MIQE (1) — Эксперименттік дизайн
Аспирантураны бітіріп, қорғауды аяқтаған көптеген ақымақтар өз бетінше тәжірибе құрастыруды, дәптерін ашып, мұғалімнің айтқанын орындауды білмейді.Соның салдарынан тәжірибелік дизайн қатаң болмай, журналдың редакциясы мына суретті де, анау да суретті жасағылары келетінін айтып, аң-таң болып жасапты.Ақымақтарды осылай жасайды!

Үйге жақынырақ эксперименттің бірінші принципі анықтау болып табыладыэксперименттік логиканың қатаңдығы.Ең іргелі нәрсе – эксперименттік жоба, ал тәжірибелік жобаның ең маңыздысы – эксперименттік деректерге сілтеме жасау, салыстыру және нанымды болу үшін мақсатты үлгіні, анықтамалық үлгіні (бақылау) және қайталаулар санын қалай орнату керек.

Мақсатты үлгібелгілі бір емдеуден кейін мақсатты генді анықтауды талап ететін үлгіні білдіреді.Анықтама үлгісіЕшқандай емделмеген үлгі болып табылады, ол көбінесе биологияда жабайы тип деп аталады.

Эксперименттік көшірмелерөте маңызды.Әдетте, нанымды қайталаулар саны үштен көп болуы керек.Биологиялық репликация деген не, техникалық репликация не екенін ажырата білу керек.

Биологиялық көшірмелер: Әртүрлі материалдармен бірдей тексеру тәжірибесі (уақыт, қондырғылар, партиялар, реакциялық тақталар).

Биологиялық қайталану
Мысал ретінде бұрышты пестицидпен өңдеуді алайық.Біз ABC үш зауытына пестицидтерді шашқымыз келеді, содан кейін ABC үш зауыты үш биологиялық көшірме болып табылады және олар әртүрлі материалдармен жүргізілген бірдей тексеру эксперименті.Бірақ эксперимент ретінде міндетті түрде бақылау қажет, сондықтан А өсімдігінің бір бұтақтарын бүрку арқылы А өсімдігінің тәжірибелік тобын құруға болады, ал бақылау тобын құру үшін А өсімдігінің басқа бұтақтарын шашыратпай.B және C үшін де солай істеңіз.

Техникалық көшірмелер (техникалық көшірмелер): Бұл әрекеттен туындаған қателерді болдырмау үшін жасалған қайталанатын эксперимент, бұл шын мәнінде бір материалға енгізілген қайталанатын тесік.Емдеуде де, бақылауда да мақсатты геннің және ішкі анықтамалық геннің қайталанатын параметрлері (кемінде үш) болуы керек.

Техникалық қайталау
Мысал ретінде пестицидтермен өңделген бұрышты алайық.А өсімдігінің тәжірибелік тобы үшін анықтаудан кейін орташа мәнді алу үшін оның мақсатты гені мен ішкі анықтамалық гені үшін тиісінше 1, 2 және 3 үш ПТР тесіктерін жасадық.Өсімдікпен күресу үшін А топтары да осылай өңделеді.Сол сияқты, B және C өсімдіктеріне бірдей өңдеуді жасаңыз.Бұл техникалық қайталау.

Айта кеткен жөнСтатистикаға енетін нәрсе – биологиялық қайталау, ал техникалық қайталау – эксперимент процесінде кездейсоқ құбылыстардың бар-жоғын тексеру, осылайша эксперимент нәтижелерін сенімді ету, яғни біз жиі айтатын болсақ, олардың орташа мәнін алу арқылы қателерді болдырмау.

Теріс басқару элементтері—NTC және NRT
NTC (Үлгісіз басқару), үлгісіз бақылау эксперименттік материалдың ластанғанын тексеру үшін пайдаланылады.Әдетте су үлгі ретінде пайдаланылады.Егер флуоресцентті реакция болса, бұл зертханада нуклеин қышқылының ластануы болғанын көрсетеді.

Бұл ластанулар: таза емес судан, эндогендік ДНҚ бар білікті емес реагенттерден, праймердің ластануынан, зертханалық жабдықтың ластануынан, аэрозольды ластаудан және т.б., RNase тазартқыштарды және RNase ингибиторларын пайдалану қажет.Аэрозольді ластануды табу ең қиын.Сіздің зертханаңыз ауада әртүрлі нуклеин қышқылдары бар түтін сияқты елестетіңіз.

NRT (кері транскриптазасыз), кері транскрипциясы жоқ бақылау, теріс бақылау ретінде кері транскрипцияланбаған РНҚ болып табылады, бұл гДНҚ қалдығын бақылау.

Генді экспрессиялау кезінде кері транскрипциядан кейінгі кДНҚ мөлшерін анықтау арқылы РНҚ мөлшері анықталады.РНҚ тазартылған кезде гДНҚ қалдығы болса, ол тәжірибе нәтижелерінде қателіктер тудырады, өйткені нақты алынған нәтижелер гДНҚ және кДНҚ болып табылады.Тек cDNA емес, жиынтық деңгейде РНҚ экстракциясы кезінде гДНҚ толығымен жойылуы керек.

MIQE (2) — үлгі ақпарат
Үлгі ақпарат деп аталатын нәрсе qPCR туралы мақаланы жариялаған кезде біз мақаланың ажырамас бөлігі болып табылатын үлгі ақпаратын анық түсіндіруіміз керек дегенді білдіреді.Сол сияқты, біз үлгілерді өңдеген кезде үлгілердің жарамдылығын қамтамасыз ету үшін өз операцияларымызды реттеуіміз керек.

Үлгіні сипаттау тек нәтиже болып табылады және біз бүкіл эксперимент кезінде алынған материалдарға көбірек назар аударуымыз керек.

Эксперименттік материалдарды таңдау
Қан үлгілері – жаңа қанды таңдаңыз, 4 сағаттан аспайды.Жасуша үлгілері – қарқынды өсу кезеңінде жаңа жасушаларды жинауды таңдаңыз.Жануарлар тіндері - жаңа, қарқынды өсіп келе жатқан тіндерді таңдаңыз.Өсімдік тіндері – жаңа, жас тіндерді таңдаңыз.

Осы бірнеше сөйлемде негізгі сөз бар екенін байқаған боларсыз: жаңа .
Жоғарыда аталған үлгілер үшін нарықтағы ең жақсы, үнемді және тұрақты жинақ олардың ДНҚ мен РНҚ-сын тез және оңай шығарып алатын Foregene жинағы болып табылады.

Қан ДНҚ шағын жинағы

Жасушаның жалпы РНҚ оқшаулау жинағы

Жануарлардың жалпы РНҚ оқшаулау жинағы

Өсімдіктің жалпы РНҚ оқшаулау жинағы

Өсімдіктің жалпы РНҚ оқшаулау жинағы Plus

Өсімдік ДНҚ оқшаулау жинағы

Эксперименттік материалдарды сақтау
Жалпы айтқанда, егер шарттар рұқсат етілсе, үлгілерді сақтау ұсынылмайды.Дегенмен, сынама алғаннан кейін бірден эксперимент жүргізе алмайтын көптеген достар бар, ал кейбіреулері сынама алу үшін далаға сұйық азот цистерналарын алып жүруге тура келеді.

Осындай еңбекқор дос үшін сіз реагенттердің шығын материалдарын түсінбейтініңізді ғана айта аламын.Қазір көптеген реагенттерді тұтынатын компаниялар РНҚ үлгілерін бөлме температурасында сақтай алатын реагенттерді шығарады және сіз оларды пайдалануды таңдай аласыз.Кәдімгі сақтау әдісі сұйық азотты сақтау болып табылады, оны тасымалдау оңай шағын сұйық азот резервуары қолданылады.Үлгіні зертханаға әкелгеннен кейін оны -80°C тоңазытқышта сақтаңыз.

РНҚ-ны қамтитын эксперименттер үшін алты сөздік принцип сақталуы керек:төмен температура, ферменттер жоқ,жәнежылдам .

Төмен температура ұғымын түсіну оңай;ферменттерсіз, RNase біз өмір сүріп жатқан әлемнің барлық жерінде бар (әйтпесе, сіз АҚТҚ-дан өлетін едіңіз), сондықтан эксперименттер жасағанда RNase-дан қалай аулақ болу керек - бұл өте маңызды түсінік;жылдам,Әлемде сынбайтын кунг-фу жоқ, тек жылдамдықты бұзуға болмайды.

Сондықтан, белгілі бір мағынада, экстракция уақыты неғұрлым қысқа болса, жинақ соғұрлым жақсы болады.НеліктенШетелдікжинағы жылдамдыққа баса назар аударады, өйткені олар оны жақсы біледі.

PS: Кейбір қыздар эксперименттерді өте мұқият жасайды, бірақ олар бірнеше жыл жұмыс істегеннен кейін слэм-данк сияқты жақсы емес.Олар Құдайдың әділетсіз екенін сезеді, басқаларға шағымданады және өмірді іздейді.Шындығында ол мұны түсінбеді.Ол РНҚ-ны жақсы қорғай алмады, ал слем-данк ойыншысы епті болды.Тәжірибе жасап жатқанда ол слем-данкты үш рет, бес рет және екі бөлумен аяқтаймын деп ойлады, бірақ экспериментті жақсы орындады.

Ескерту: Баяуырақ, RNase инвазиясының ықтималдығы жоғары.Өзіңізді жылдам болуға қалай үйрету керек?Амал жоқ, тек көбірек жаттығу.

Әртүрлі эксперименттер мен әртүрлі үлгілер үшін әлі де көбірек әдебиеттерді оқып, өңдеудің сәйкес әдісін таңдау қажет.Үлгіні жинау және сақтау процесі үшін MIQE оның қағазда анық жазылуын талап етеді, осылайша рецензенттер қағаздың сенімділігін тексере алады, сондай-ақ таң қалған жастарға тәжірибеңізді қайталау ыңғайлы.

Биологиялық эксперименттер қиын болғанымен, олар жоғары деңгейлі.Сақ болмасаң, дүниені төңкеріп жіберуің мүмкін.Мысалы, SARS-ті биохимиялық дағдарысқа айналдыру немесе 1,3 миллиард адамды құтқару үшін гибридті күріш жасау.Төмендегі сурет химиялық эксперимент, оның цикке ұқсайтын түріне қарап-ақ өз зерттеулеріңіз үшін қаншалықты мақтанатыныңызды түсінуіңіз керек.Оны ұмыт, оны қаралама.

MIQE (3) – нуклеин қышқылының экстракциясы.
Нуклеин қышқылын алу үлкен оқиға және барлық молекулалық биология тәжірибелері нуклеин қышқылын алудан басталады.Ең алдымен, нуклеин қышқылының экстракциясы бойынша MIQE мазмұнын көшіріп алайық.

Бұл пішінге қарап, сіз бетінде қала алмайсыз.Пішін - бұл догма.Үздік студент болу үшін оның себебін сұрау керек.Бұл кестенің негізгі мазмұны: ІздеуРНҚ тазалығы, тұтастығы, консистенциясы және экстракция мөлшері .

Бірінші бөліміпроцесс немесе құрал нуклеин қышқылын алу сатысы болып табылады.Егер сіз экстракция үшін автоматты нуклеин қышқылы экстракторын қолдансаңыз (кеңейтілген, сатып алу үшін маған хабарласыңыз), құралдың үлгі атауын көрсетуіңіз керек.

Жинақтың атауы және

өзгерту мәліметтері үшін қандай жинақ пайдаланылғаны, қандай арнайы реагенттер қосылғаны немесе қандай арнайы операциялар жасалғаны басқалар сіздің тәжірибеңізді оңай қайталай алатындай етіп анық түсіндірілуі керек.

Кейбір адамдар арнайы сынамаларды алу кезінде бұл олардың құпия қаруы деп ойлап, басқаларға айтпайды.Оны құпия ұстай отырып, олар сіздің мақалаңызды жарқырататын мүмкіндіктен де айырылады.Ақылды болма, ғылыми зерттеуде елдің қарт Жаңғасынан да адал болуың керек, ақылды болғың келсе, мақала сені ақымақ етеді.

жинақтың өнім нөмірін есте сақтау керекжинаққа тапсырыс бергенде және мақаланы жазасыз.Жинақта әдетте екі нөмір бар: Cat—каталог нөмірі (өнім нөмірі, мақала нөмірі), Лот—өнім партиясының нөмірі (Өнімнің қай партиядан шыққанын көрсету үшін пайдаланылады).

Сонымен қатар, биохимиялық реагенттерге тапсырыс беру кезінде CAS нөмірі жиі қолданылады, мен оны бірге танымал етемін.CAS нөмірі - Америка химиялық қоғамы әрбір жаңа химиялық препаратқа беретін сан.Әдетте үш сан сызықша арқылы қосылады.Рушуйдің CAS нөмірі: 7732-18-5.Химиялық заттардың жиі бірнеше бүркеншік аттары болады, бірақ CAS нөмірі бірегей.Дәріге тапсырыс беру кезінде алдымен оның CAS нөмірін тексеруге болады.

Үйге жақынырақ, неге біз бұл нәрселерді анық сипаттауымыз керек?Шын мәнінде, бұл РНҚ экстракциясының сапасын тексеру.Құралдар мен жинақтарды пайдалану РНҚ экстракциясын біркелкі етеді.Кәдімгі зертханалардың экстракция масштабы үлкен емес және оны жинақтармен алуға болады.

DNase немесе RNase өңдеуінің мәліметтері
Флуоресцентті сандық ПТР маңызды мәселесі ДНҚ-ның ластануын болдырмау болып табылады және ластану бар болса эксперимент жасамаңыз.Сондықтан тәжірибелік процестегі ДНҚ толығымен және толығымен жойылғанын көрсету үшін ДНҚ өңдеу үшін қолданған процесті айту міндетті болып табылады.схемалық диаграммамен көрсетілген.

РНҚ және ДНҚ схемалық диаграммасы
Жалпы алғанда, ДНҚ-ны жою әдісі экстракциядан кейін РНҚ-ны DNase-мен өңдеу болып табылады.Дегенмен, бұл салыстырмалы түрде ескі әдістер.Коммерциялық РНҚ экстракциялық жинақтары экстракция процесінде ДНҚ-ны DNase қоспай-ақ жоюға мүмкіндік алды.Мысалы, Foregene жинақтарының сериясы .

Ескерту: РНҚ экстракциясы кезінде ДНҚ-ны жою өте қауіпті екі жүзді қылыш болып табылады, ол РНҚ экстракциясының жұмыс уақытын ұзартады және РНҚ деградация қаупін арттырады.Негізінен, бұл РНҚ шығымдылығы мен тазалығы арасындағы келіссөз.

Сонымен қатар, кремний диоксиді негізіндегі адсорбциялық бағанға қосылатын DNase мөлшері өте аз және әсерге жету үшін жоғары сапалы DNase қолданылуы керек.Оңтайландырылмаған DNase тез және толық қорытыла алмайды.Бұл саудагердің техникалық деңгейін сынау.Әрине, ДНҚ-ны DNaseсіз жоюға болатынын мақтан ететін оғаш саудагерлер бар.ДНҚ-ны DNase-сыз толығымен жоюға болады деп мақтанатын кез келген адамды бұзақы деп айтуға болады.ДНҚ салыстырмалы түрде тұрақты қос тізбекті құрылым және оны тек сөйлесу және күлу арқылы жою мүмкін емес.

Ластануды бағалау
бағалау әдісі: электрофорезді анықтау, 1% агароза, 6В/см, 15мин, жүктеу 1-3 ул.

Нуклеин қышқылының сандық талдауы
әдетте ультракүлгін спектрофотометр көмегімен өлшенеді.Алдымен OD260, OD280 және OD230 үш мәнінің мағынасын ашуға рұқсат етіңіз.
·OD260nm: Бұл нуклеин қышқылының ең жоғары сіңіру шыңының жұтылу толқын ұзындығы және ең жақсы өлшенген мән 0,1 мен 1,0 аралығында болады.Олай болмаса, үлгіні диапазонға жеткізу үшін сұйылтыңыз немесе концентраттаңыз.
·OD280nm: Бұл ақуыз және фенолдық заттардың ең жоғары сіңіру шыңының сіңіру толқын ұзындығы.
·OD230nm: Бұл көмірсулардың ең жоғары сіңіру шыңының сіңіру толқын ұзындығы.

Әрі қарай, әрбір көрсеткіштің рөлі туралы сөйлесейік.A260 үшін оны нуклеин қышқылының шығымын өлшеу үшін пайдалануға болады.OD260=1 болғанда, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Тазалық үшін біз жиі көретін арақатынастарды қарастыруымыз керек: OD260/280 және OD260/230.
·Таза ДНҚ: OD260/280 шамамен 1,8-ге тең.Ол 1,9-дан жоғары болса, РНҚ-ның ластануы, ал 1,6-дан төмен болса, белок пен фенолдың ластануы бар екенін көрсетеді.
·Таза РНҚ: 1,7
·OD260/230: ДНҚ немесе РНҚ болсын, анықтамалық мән 2,5.Ол 2,0-ден төмен болса, қанттың, тұздың және органикалық заттардың ластануы бар екенін көрсетеді.

РНҚ тұтастығы

РНҚ тұтастығын өлшеу өте маңызды.Жалпы, 28S және 18S РНҚ арасындағы жарықтылық екі жақты байланыс екенін тексеру үшін РНҚ денатурация гелі тәжірибесін жасау қажет.Үшінші жолақ 5S пайда болғанда, бұл омыртқасыздардан басқа РНҚ ыдырай бастағанын білдіреді.

РНҚ сапасын бағалауға арналған деректер: Жоғарыда көрсетілген сынақтарға қосымша, РНҚ-ның көрінбейтін түрде ыдырауын анықтай алатын Experion автоматты электрофорез жүйесінің RQI тұтастығына сынағы сияқты РНҚ тұтастығына қатысты бірнеше жетілдірілген құрал сынақтары бар.

Ғылыми зерттеулерде флуоресцентті сандық ПТР мақсатты ген мен ішкі анықтамалық генді салыстыру болып табылады.Сондықтан РНҚ үлгісін сақтау, РНҚ экстракциясы және т.б. процесінде РНҚ тұтастығын қамтамасыз ету басты мақсат болып табылады.

РНҚ тұтастығы мақсатты ген мен ішкі анықтамалық ген арасындағы тепе-теңдікке қалай әсер ететінін төмендегі суреттен оңай түсінуге болады.Деградация геннің толық болмауына әкеліп соғады, мейлі ол ішкі референттік геннің толық болмауы немесе мақсатты геннің толық болмауы деректерге үлкен әсер етеді.

Нысаналы ген мен анықтамалық геннің схемалық диаграммасы дұрыс болмауы керек

Ингибирлеу сынағы (КТ мәні жоғары немесе төмен концентрацияда немесе басқа жағдайларда басылады ма)

Бұл суретті мысалға алсақ, бес қисықтың Ct мәндері келесідей болады.КТ мәндерінің қисық сызықтар арасында таралуы біркелкі емес, ал жоғары және төмен концентрацияларда Ct мәндері кешіктіріледі, бұл ПТР тежелу жағдайы.

Негізгі нүкте: РНҚ экстракциясы процесінде қате түсініктерден бас тартып, дұрысын орнату керек.

Қате идея: РНҚ экстракциясы алынған РНҚ мөлшері неғұрлым көп болса, соғұрлым жақсы деп есептей отырып, тек өнімділікке ұмтылады.Шындығында, сандық анықтауды жүргізгенде, гендер саны онша көп болмаса, бізге көп РНҚ қажет емес.Сіз шығаратын РНҚ мөлшері жеткілікті.

Дұрыс тұжырымдамасы:РНҚ экстракциясы тазалық, тұтастық және консистенцияға ұмтылуы керек.Тазалық келесі кері транскрипцияның тежелуін және деректерге ДНҚ әсер етпейтінін қамтамасыз ете алады.Тұтастық мақсатты реттілік пен ішкі сілтемелердің тепе-теңдігін қамтамасыз етеді.Жүйелілік үлгінің тұрақты жүктелуін қамтамасыз етеді.

MIQE (4) – кері транскрипция
Қате түсінік: үлкен үлгі көлеміне ұмтылу.
Дұрыс түсінік: Жүктелген РНҚ мөлшеріне қарамастан, консистенцияға (тұрақтылыққа) ұмтылыңыз, кері транскрипцияның тиімділігі тұрақты болып қалады, бұл cDNA-дағы айырмашылықтар мРНҚ-дағы айырмашылықтарды шынымен көрсете алатынын қамтамасыз етеді.
Біз бұл процесті схемалық диаграммамен түсіндіреміз:

Кері транскрипция тиімділігінің схемалық диаграммасы шындыққа сәйкес келмейді
Ең алдымен, кері транскрипция процесі мен ПТР процесі арасындағы айырмашылықты түсінуіміз керек.ПТР бірнеше қыздыру және жасыту процестерінен өтеді және мақсатты фрагмент экспоненциалды түрде өседі;кері транскрипцияда бұл процесс болмағанымен, біз кері транскрипцияны шын мәнінде бір-бір деп елестете аламыз Репликация процесі кезінде РНҚ-ның көптеген бөліктері

cDNA ақпаратының сонша көп бөлігін алуға болатындықтан, оны қазірге дейін түсіну керек, өйткені үлкен және кіші фрагменттер кері транскрипцияланған және бір фрагментке назар аудару мүмкін емес.Ал РНҚ мөлшері салыстырмалы түрде аз болғандықтан, алынған кДНҚ мөлшері де күшейту әсері бар ПТР-ға қарағанда салыстырмалы түрде аз, сондықтан оны анықтау мүмкін емес.

cDNA электрофорезінің нәтижелері
Екіншіден, ең дұрысы, кері транскрипция бір-бірден орындалады, бірақ ешбір компанияның кері транскриптазасы бұл нәтижеге жете алмайды.Негізінен, кері транскриптазалардың көпшілігінің тиімділігі 30-50% арасында ауытқиды.Егер солай болса, біз салыстырмалы түрде тұрақты кері транскрипция тиімділігіне ие боламыз, бұл суретте көргіміз келетін нәрсе: 3 РНҚ 2 cDNA алады, 6 РНҚ 4 cDNA алады, сондықтан үлгі қанша жүктелсе де, кері транскрипцияның тиімділігі салыстырмалы түрде тұрақты.Біз кері транскрипцияның тиімділігі тұрақсыз және жоғары концентрация тежелген жағдайды көргіміз келмейді.

Сонымен, кері транскрипцияның тиімділігі тұрақты екенін қалай тексеруге болады?Әдіс өте қарапайым, тек салыстыру сынамасын жасау керек: бірі РНҚ екі еселенген сұйылтудан кейін кДНҚ-ға кері транскрипциялау, екіншісі cDNA-ға кері транскрипциялаудан кейін екі еселенген сұйылтуды жасау, содан кейін алынған көлбеуді көру үшін qPCR жүргізеді.Үздік студент ретінде сіз оны бірнеше секундта түсінуіңіз керек.Төменде көрсетілгендей:

Кері транскрипция тиімділігінің тұрақтылығын тексеру үшін РНҚ және кДНҚ сұйылту
Кері транскриптаза және жинақ
Қалай тамаша флуоресцентті сандық ПТР тамаша кері транскриптаза мен жинаққа ие болуы мүмкін.Кері транскриптаза көзіне қарай шамамен екі түрге бөлінеді, AMV немесеM-MLV, және олардың өнімділігі кестеде көрсетілгенмен бірдей.

RNase H белсенділігі
RNase H - рибонуклеаза H, қытайша атауы - рибонуклеаза Н, ол ДНҚ-РНҚ гибридті тізбегіндегі РНҚ-ны арнайы гидролиздей алатын эндорибонуклеаза.RNase H бір тізбекті немесе екі тізбекті ДНҚ немесе РНҚ-дағы фосфодиэфирлік байланыстарды гидролиздей алмайды, яғни бір тізбекті немесе екі тізбекті ДНҚ немесе РНҚ-ны қорыта алмайды.КДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезінде жиі қолданылады.

Бұл біртүрлі нәрсе.Біз кері транскриптазаның RNase H белсенділігі бар екенін айтамыз, бұл кері транскриптазаның құрамында RNase H бар емес, және RNase H-ны кері транскриптазадан бөлу мүмкін болмауы мүмкін, мүмкін кері транскриптазадағы белгілі бір топтардың конформациясына байланысты Бұл белсенділік кері транскриптазадан туындайды.

Сондықтан AMV кері транскрипцияның жоғары тиімділігіне қарамастан, оның RNase H белсенділігі кДНҚ шығымдылығын төмендетеді.Әрине, реагенттер өндірушілері cDNA шығымдылығын арттыру үшін кері транскриптазадағы RNase H белсенділігін мүмкіндігінше жою үшін өз өнімдерін үнемі оңтайландырады.
Күйдіру температурасы

Әртүрлі температурадағы РНҚ-ның екіншілік құрылымы
Әртүрлі температуралардағы РНҚ-ның қайталама құрылымы үшін жоғарыдағы суретті қараңыз және арнайы температура мен тұз концентрациясы жағдайында мақсатты фрагменттің қайталама құрылымын анықтау үшін mFold онлайн құралын пайдаланыңыз.55°С температурада РНҚ-ның екінші реттік құрылымы әлі де өте күрделі, кері транскриптаза жұмыс істей алмайды, ал екінші реттік құрылым 65°С дейін толық шешілмейді, ал AMV және M-MLV оптималды температурасы осы температурадан әлдеқайда төмен.
не істеу?Қосымша құрылым - шаблонның өзін толықтырушы жұптасуы, бұл праймер мен кері транскриптаза мен шаблон арасындағы күшті бәсекелестікке әкеледі, нәтижесінде төмен E және нашар қайталану сияқты бірқатар мәселелер туындайды.

не істеу?Жасыту температурасын мүмкіндігінше арттырыңыз .

Көптеген реагенттер өндірушілері гендік инженерия арқылы кері транскриптазаны жақсартады.Кейбіреулер реакция температурасын жоғарылатады, мысалы, Джифан және Айделай, ал кейбіреулері фермент пен РНҚ үлгісі арасындағы жақындықты жақсарту үшін RNase H ферментінің белсенді тобын жояды.Жоғары жақындық қайталама құрылымды бәсекеге қабілетті түрде сығып, біркелкі оқи алады, сонымен қатар кері транскрипцияның тиімділігін айтарлықтай жақсартады.
Негізгі нүкте: Кері транскрипцияның кері транскрипция тиімділігінің консистенциясы (ферменттер тек тиімді ғана емес, сонымен қатар тұрақты болуы керек) жүктелген үлгі мөлшеріне жету үшін маңыздырақ, егер ол ерекше ауқымды флуоресцентті сандық ПТР болмаса, ол мүлдем мүмкін болмайды.Бірнеше cDNA.
Әртүрлі өндірушілер де дәйектілікке ұмтылу үшін біраз күш жұмсады.Мысалы, қазір көптеген компаниялар кері транскрипцияны сатуға арналған стандартты жинақ ретінде жинады, бұл жақсы таңдау.
Мысалы, Foregene RT Easy Series жинақтары:

RT Easy I (бірінші тізбекті cDNA синтез жинағына арналған негізгі премикс)

MIQE (5) – мақсатты ген туралы ақпарат

Жоғарыдағы сурет түсіндіреді
1. Бұл геннің қайталанатын эксперименттер үшін тиімді екендігін, әдетте, қайталанатын эксперименттер арқылы тексеруге болады.
2. Ген идентификаторы, сіз білесіз.
3. Ген ұзындығы, мақсатты геннің жалпы ұзындығы сөзсіз проблема емес.Праймерлерді жобалау кезінде күшейту тиімділігін қамтамасыз ету үшін ампликон ұзындығының 80-200 бит/п аралығында болуын қамтамасыз етіңіз.
4. Sequence Blast салыстыру ақпараты, спецификалық емес күшейтуді болдырмау үшін мақсатты генді гендік банкте салыстыру қажет.
5. Псевдогендердің болуы.Псевдоген - қалыпты генге ұқсас, бірақ өзінің қалыпты қызметін жоғалтқан ДНҚ тізбегі.Ол көбінесе эукариоттардың көп генді отбасында болады.Ол әдетте ψ арқылы көрсетіледі.Бұл кодтау генінің тізбегіне өте ұқсас геномдағы функционалды емес геномдық ДНҚ көшірмесі., әдетте транскрипцияланбайды және нақты физиологиялық мағынасы жоқ.
6. Праймерлердің экзондар мен интрондарға қатысты орналасуы.Алғашқы жылдары ДНҚ-ның ластану мәселесін шешкен кезде біз көбінесе праймерлердің, экзондардың және интрондардың позицияларына назар аудардық және ДНҚ күшейтуін болдырмау үшін әдетте интрондар арқылы праймерлерді жобалауды қарастырдық.Төмендегі суретті қараңыз: қара түс интрондарды, түрлі көк түстер экзондарды, қызғылт түс қарапайым праймерлерді, ал ашық қызыл түс интрондарды қамтитын праймерлерді білдіреді.

Схематикалық, ешқашан дұрыс емес
Бұл қандай тамаша жоспар болып көрінеді, бірақ шын мәнінде, көп жағдайда транс-интрондық праймерлер ойлағандай сиқырлы емес, сонымен қатар олар арнайы емес күшейтуді тудырады.Сондықтан ДНҚ-ның ластануын болдырмаудың ең жақсы жолы - ДНҚ-ны толығымен жою.
7. Конформацияны болжау.Осы мысалды қайта пайдаланып, арнайы температура мен тұз концентрациясында мақсатты фрагменттің қайталама құрылымын анықтау үшін mFold онлайн құралын пайдаланыңыз.

Әртүрлі температурадағы РНҚ-ның екіншілік құрылымы
Қосымша құрылым үлгінің өзін толықтырушы жұптастыру болып табылады, бұл праймер мен үлгіні жұптастыру арасында күшті бәсекелестікке әкеледі және праймерді байланыстыру мүмкіндігі азырақ, нәтижесінде төмен E және нашар қайталану сияқты бірқатар мәселелер туындайды.Бағдарламалық жасақтаманы болжау арқылы, егер қосалқы құрылым мәселесі болмаса, бұл тамаша болар еді.Егер бар болса, біздің кейінгі мақаламыз бұл мәселені қалай шешуге болатынын арнайы талқылайды.

MIQE (6) — qPCR олигонуклеотидтері

Флуоресцентті сандық ПТР үшін сіз күн сайын күресетін бірінші нәрсе - РНҚ экстракциясы, ал екінші нәрсе праймер дизайны болуы мүмкін.
Біріншіден, біз әлі де MIQE бақылау тізіміне сәйкес праймер дизайны туралы ережелерді тексереміз.Қарапайым болғаны сонша, қаскөйлер күле алады, және біз оны бір сөйлеммен аяқтай аламыз: праймер зондының реті мен орнын және модификация әдісін біліңіз.Праймерді тазарту әдісі үшін праймер синтезі қазіргі уақытта соншалықты арзан, qPCR PAGE және одан жоғары тазарту әдістеріне лайық және синтез құралының ақпараты маңызды емес.Көптеген адамдар ондаған жылдар бойы праймерлерді жасайды және синтезатордың ABI3900 екенін білмейді.
Праймерді жобалау принциптеріне келетін болсақ, оларды жаттап алудың қажеті жоқ, өйткені праймерді жобалау бағдарламалық жасақтамасының немесе онлайн құралдарының көпшілігі бұл мәселелерді шеше алады (ұсынылған онлайн құралы primer3.ut.ee/), ал праймер дизайнының 99,999% қолмен жасалмайды Қараңыз, автор кейде күніне жүздеген праймерлерді жобалайды, егер сіз бір-бірлеп оқысаңыз, ол қиылысады.
Праймерлер әзірленгеннен кейін келесі тармақтарды тексеріңіз:
1. 3′ ұшына жақын жобалау праймерлері: cDNA бірінші тізбекті синтезі үшін олиго dT праймерлерін пайдаланған жағдайда кері транскрипцияның тиімділігі мен РНҚ тұтастығын ескере отырып, күшейту тиімділігін арттыру үшін жобаланған праймерлер 3′ ұшына жақын жобалануы керек.Төмендегідей түсіндіру үшін суретті пайдаланыңыз (мұны түсінудің ешқандай жолы жоқ):

Неліктен праймерлерді 3′ ұшына жақын етіп жасау керек, бұл дұрыс болмауы керек
2. TM мәні: Tm мәні 55-65°C (себебі экзонуклеаза белсенділігі 60°C температурада ең жоғары), ал GC мазмұны 40%-60%.
3. BLAST: геномның спецификалық емес күшейтуін болдырмау үшін Blast қосымша тексеру үшін қолданылуы керек.

MIQE(7) — qPCR процесі

1. qPCR жинағы
MIQE талаптарына сәйкес біз мақалада реакцияның толық шарттарын, соның ішінде ПТР реакция жүйесінің конфигурациясын, қандай жиынтықты, өндіруші кім, реакция жүйесі қаншалықты үлкен, бояу әдісі немесе зонд әдісі қолданылады ма, ПТР бағдарламасының параметрлерін нақты сипаттауымыз керек.Ардагер жүргізушілер жиынтық таңдалғанша, жоғарыда көрсетілген ақпарат негізінен анықталғанын анық табады.
Қазіргі уақытта флуоресцентті сандық ПТР жинақтарын жасау және өндіру өте жетілген технология болып табылады.Сіз өте нашар өндірушілерді таңдамасаңыз, проблемалардың ықтималдығы жоғары емес, бірақ біз әлі де сізбен бірнеше ой бөліскіміз келеді:
Ыстық іске қосу Taq ферменті:ПТР-ның ең маңызды бөлігі ыстық басталатын Taq ферменті болып табылады.Нарықтағы ыстық басталатын ферменттер әдетте екі түрге бөлінеді, бірі химиялық түрлендірілген ыстық старт ферменті (сіз оны парафинді ендіру ретінде елестете аласыз), екіншісі - антиденелерді модификациялауға арналған ыстық басталатын фермент (антиген-антиденені байланыстыру).Химиялық түрлендіру ферменттерді ыстықтай бастаудың ерте жолы болып табылады.Белгілі бір температураға жеткенде фермент өзінің белсенділігін босатады.Антиденелермен модификацияланған ыстық іске қосу ферменті ферменттің белсенділігін блоктау үшін биологиялық әдістерді пайдаланады.Белгілі бір температураға жеткенде антидене белок ретінде денатурацияланады және инактивацияланады, ал ферменттің белсенділігі іске қосылады.

Дегенмен, мұның қандай пайдасы бар?Бұл жағдайда антиденемен модификацияланған ферменттердің босап шығу белсенділігі химиялық түрлендірілген ферменттерге қарағанда жылдамырақ, сондықтан сезімталдық жағынан антиденелермен модификацияланған ферменттер шамалы артықшылыққа ие, сондықтан нарықтағы жиынтықта негізінен химиялық модификацияланған ферменттер жоқ.Егер бар болса, онда бұл өндірушінің технологиясы әлі мыңжылдық дәуірінде тұрып қалды.
Магний ионының концентрациясы:ПТР реакциясында магний ионының концентрациясы өте маңызды.Магний ионының сәйкес концентрациясы Taq ферментінің белсенділігін босатуға ықпал етеді.Егер концентрация тым төмен болса, ферменттің белсенділігі айтарлықтай төмендейді;егер концентрация тым жоғары болса, ферментпен катализделген спецификалық емес күшейту күшейеді.Магний иондарының концентрациясы сонымен қатар праймерлердің күйдірілуіне, шаблонның және ПТР өнімдерінің балқу температурасына әсер етеді, осылайша күшейтілген фрагменттердің шығуына әсер етеді.Магний иондарының концентрациясы әдетте 25 мМ-де бақыланады.Әрине, жақсы жинақ үшін магний иондарының концентрациясын жақсы бақылау керек.Кейбір саудагерлер реагентке магний ионының концентрациясын автоматты түрде реттеу әсеріне қол жеткізе алатын магний ионының хелатизаторын қосады.
Флуоресцентті бояу концентрациясы:Біз әдетте қолданатын SYBR Green болып табылатын флуоресцентті бояғыш негізінен қос тізбекті ДНҚ-ның кіші ойығымен байланысу арқылы флуоресценцияны тудырады, өйткені бояғыштың қос тізбекті ДНҚ-мен байланысуы спецификалық емес, яғни қос тізбекті ДНҚ онымен біріктірілген кезде, флуоресцентті ДНҚ онымен біріктірілген кезде, флуоресценцияны түзеді. фондық сигнал құрайды.
PS: Жарыққа сезімтал қасиеттеріне байланысты нарықтағы өнімдер әдетте қоңыр мөлдір емес центрифуга түтіктеріне оралады (төмендегі суретте көрсетілгендей).Дегенмен, бұл мәселеге тап болады.Сынама алу кезінде сұйықтықтың сорылғанын көру қиын.Осыған байланысты Цинке шынымен де пайдаланушыға ең ыңғайлы (төмендегі суретте көрсетілгендей) және мөлдір түтік мөлдір емес қаңылтыр қапшыққа оралған.Содан кейін жарықтан аулақ болу және сынама алу ыңғайлылығын ескере отырып, оны қалайы қапшыққа салыңыз.Сіз дұрыс өнім нөмірін таңдауыңыз керек.TSE204 - бұл өте үнемді өнім, бұл мені шөп отырғызғым келеді.

Флуоресцентті бояудың концентрациясы да өте маңызды.Егер концентрация тым төмен болса, күшейту қисығы кейінгі кезеңде жоғары көтерілмейді және мінсіз емес;егер концентрация тым жоғары болса, ол шу кедергісін тудырады.Флуоресцентті сандық ПТР негізінен КТ мәніне байланысты болғандықтан, флуоресцентті бояудың концентрациясы дұрыс реттелмесе, төменгі нүкте жоғары нүктеден жақсырақ.Әрине, бояудың сәйкес концентрациясы ең жақсы.

ROX: ROX бояғыштары жақсы флуоресценция сигналының қателерін түзету үшін қолданылады.Кейбір аспаптар өндірушілері калибрлеуді қажет етеді, ал басқалары талап етпейді.Мысалы, Thermo Fisher Scientific нақты уақыттағы ПТР күшейту құралын пайдалану әдетте калибрлеуді қажет етеді, соның ішінде 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, т.б. Жалпы жинақ нұсқаулары оны сипаттайды.
Foregene's qPCR Mix құрамында әртүрлі үлгілерде қолдануға ыңғайлы ROX бояуы да бар.

Нақты уақыттағы ПТР жинағы-Такман

Әлсіз сутегі байланысын өңдеу: Әлсіз сутектік байланыстарды өңдеу салыстырмалы түрде техникалық мәселе.Көптеген жинақтардың нұсқаулықтарын ештеңе оқымаған, бірақ олардың ешқайсысы бұл тақырыпты айтқан жоқ.Шын мәнінде, бұл өте маңызды.Негіздердің қосындысы негізінен сутектік байланыстардың беріктігіне байланысты.Күшті сутегі байланыстары қалыпты күшейту болып табылады, ал әлсіз сутектік байланыстар спецификалық емес күшейтуге әкеледі.Әлсіз сутектік байланыстарды жақсы жою мүмкін болмаса, спецификалық емес күшейтуді болдырмауға болмайды.Автордың пікірінше, бұл мәселені бірнеше компания ғана байқаған.Жинақты сатып алғанда, сіз таңдағыңыз келетін жинаққа қатысты осыған байланысты шешімді қарастырғаныңызға сілтеме жасай аласыз.

Реакция көлемі: 20-50ul жүйесі жиі пайдаланылады, ал кішірек көлемдер қателерді тудыруы мүмкін.Жалпы айтқанда, жинақ нұсқаулары ПТР реакциясының көлемдерін пайдалануды ұсынады.Ақылды болмаңыз және шығындарды үнемдеу үшін кішірек көлемдерді пайдаланыңыз.мақсаты.Саудагерлер ұсынған көлем шын мәнінде сыналған және олар шағын көлемдер туындаған қателер мәселесін шеше алмайтын болуы мүмкін.
2. Түтік пластинасының өндірушісі және өнім нөмірі
Флуоресцентті сандық ПТР принципін бәрі біледі.Флуоресценцияны жинау негізінен ПТР түтіктерінің қақпақтары арқылы жүзеге асырылады.ПТР шығын материалдарын таңдағанда, екі тармаққа назар аударыңыз: жақсы жарық беру және құралға жарамды.Жалпы алғанда, негізгі брендтердің тақталары мен түтіктері жақсы, бірақ бейімделу тұрғысынан мұқият таңдау керек, әйтпесе сіз құралды пайдалана алмайсыз.

4. Жоғары деңгейдегі білім

MIQE (8) — qPCR валидациясы
Бұл qPCR бағдарламасының басты басымдығы!Мұнда қаншама батырлар құмға батып кетті.Әрине, сіздің де жолыңыз болуы мүмкін және сіз зерттеген гендер қарапайым, сондықтан сіз желдің бойымен мұз үңгірімен жүздіңіз.qPCR тексеру ақпараты деректердің сенімділігін тексеруге арналған.Біз қажетті тексеру ақпаратын төмендегідей тізімдейміз:

1. Ерекшелік сынағы
Мақсатты генді күшейту ерекшелігі электрофорез суретінің бір жолақ екендігін тексеру арқылы тексеріледі;реттілігін тексеру;шың картасының жалғыз екенін көру үшін балқу қисығы;ферменттердің ас қорытуын тексеру және басқа әдістер.
Мұнда біз тқисықтарды балқыту әдісін қолдану арқылы спецификалық емес күшейтуді талдау.Жалпы айтқанда, біз праймерлерді құрастырған кезде өнім фрагментінің өлшемі 80-200bp диапазонында болуы керек, бұл ПТР өнімінің балқу температурасын 80-85 °C диапазонында етеді.Сондықтан, егер әртүрлі шыңдар болса, онда басқа арнайы емес күшейту өнімдері болуы керек;шыңы 80 ° C төмен пайда болса, ол әдетте праймер димер болып саналады;егер шыңы 85°C жоғары болса, бұл әдетте ДНҚ-ның ластануы немесе үлкен фрагменттердің бейспецификалық күшейтілуі болып саналады.
Ескертпе: Кейде 80°C температурада бір ғана шың болады.Қазіргі уақытта бұл тұжырымдаманы ұстану керек.Күшейтудің нәтижелері барлық праймер димерлері болуы мүмкін.

Қалыпты балқу қисығы (спецификалық емес күшейтусіз бір шың)

Проблемалық балқу қисығы (жалған шыңдардың спецификалық емес күшейтілуі)
【Жағдайды талдау】

Негізгі шыңы бар, бірақ праймер димер маңызды
Төмендегі суреттегі бір шыңды балқу қисығы бұл тамаша эксперимент деп ойлап, көзіңізді оңай алдауы мүмкін, бірақ нәтиже мүлдем қате.Бұл кезде балқу температурасына қарау керек.Ең жоғары температура 80 ° C-тан төмен, бұл толығымен праймер-димер.

Мақсатты фрагмент жоқ, барлық праймер димерлері
Міне, ағам тоқтай алмайды.Төмендегі сурет маған ұялы телефонмен түсірілген бір сұмдық жіберген сурет.Ол пайдаланған реактивтердің барлығы өнеркәсіпте жиі қолданылатын брендтер.Ол бір T-префикс брендінен басқа Т-префикс брендіне ауысты.Менің ойымша, сіз оны әлдеқашан болжап алдыңыз.Маған жылап жіберді: «Бірінші суретте қолданылған реагент тым жақсы, ал шыңы жалғыз.Кейінірек, сіз ұсынған реагентті қолданғаннан кейін ол аралас шыңдары бар екінші суреттегідей болады.Сен мені бақытсыз қылдың.«
Екі графикті ажыратыңыз.Бір қарағанда біреуінің шыңы бір, екіншісінің қос шыңы бар.Бос сөз, бір шың әрине жақсы.Бұл рас па?
Dou E-ден де жаман, төмендегі суретке екі суретті салсам, бірден түсінесіз.Шындығында, біз мұндай суретке оңай шал болып қаламыз.Мұқият талдаудан кейін біз мынаны анықтадық: бірінші фигураның шыңы 75 ° C, бұл толығымен праймер димер;екінші санның шыңы 75°C және 82°C температурада пайда болады, кем дегенде бар Өнім пайда болады.

Оқушылардың кері байланыс суреттері
Сондықтан негізгі мәселе реагенттер мәселесі емес, праймерді жобалау мәселесі.Сонымен қатар, бұл кейбір ірі брендтердің темірдің сапасы жоқ екенін дәлелдейді және ағамның бұрын айтқанын дәлелдейді: Сіздің мақалаңызды қолдайтын реагент бренді емес.Бұл сіздің мақалаңыз реагенттердің брендін көтерді.Елестетіп көріңізші, егер қаскөй реагенттерді ауыстырмаса, журналға қате деректер жіберіліп, қайғылы оқиға болады.
2. Бланкі басқару элементінің Ct мәні
Түсіндірмеңіз, егер бос басқару элементінде Ct мәні болса, бұл ластану емес пе?Дегенмен, сіз әлі де қандай бос басқару элементінде Ct мәні бар екенін түсінуіңіз керек.Егер бұл NTC болса, бұл реагенттің ластануы сияқты бөтен ДНҚ бар екенін білдіреді.Егер бұл NRT болса, бұл экстракцияланған РНҚ-да ДНҚ ластануы бар екенін білдіреді.
3. Стандартты қисық
Көлбеу және есептеу формуласын қоса алғанда, ПТР тиімділігін формула арқылы есептеуге болады.Мінсіз эксперимент стандартты қисық сызығының еңісі 3,32-ге, ал R² 0,9999-ға жақындау үшін қажет.
4. Сызықтық динамикалық диапазон
Реакцияның динамикалық диапазоны сызықтық.Стандартты қисық сызығын құру үшін пайдаланылатын шаблонға сәйкес динамикалық диапазон кем дегенде 5 концентрация градиентін қамтуы керек және жоғары концентрация градиенттерінде және төмен концентрация градиенттерінде Ct мәндерінің өзгеруіне назар аудару керек.
5. Анықтау дәлдігі
qPCR нәтижелеріндегі өзгерістер, яғни нашар қайталану, яғни нашар дәлдік температура, концентрация және жұмыс сияқты көптеген факторларға байланысты.Көшіру саны азайған сайын qPCR дәлдігі әдетте аз бақыланатын болады.Ең дұрысы эксперимент ішіндегі вариация, бұл техникалық вариация биологиялық вариациядан ерекше болуы керек және биологиялық көшірмелер топтар немесе өңдеулер арасындағы qPCR нәтижелеріндегі статистикалық айырмашылықтарды тікелей шеше алады.Атап айтқанда, диагностикалық талдаулар үшін сайттар мен операторлар арасындағы ең жақсы талдау аралық дәлдігі (қайталануы) туралы хабарлау қажет.
6. Анықтау тиімділігі және LOD (мультиплексті qPCR)
LOD – анықталған оң үлгілердің 95% ең төменгі концентрациясы.Басқаша айтқанда, мақсатты ген репликацияларының жиынтығының құрамындағы LOD концентрациясы сәтсіз реакциялардың 5% аспауы керек.Мультиплексті qPCR талдауын орындаған кезде, әсіресе нүктелік мутацияларды немесе полиморфизмдерді бір мезгілде анықтау үшін мультиплекс qPCR бір түтікте бірнеше мақсатты фрагменттердің дәлдігі бұзылмайтынын дәлелдеуді қамтамасыз етуі керек, бірнеше анықтау және жалғыз түтікті анықтау Тиімділігі мен LOD бірдей болуы керек.Әсіресе жоғары концентрациялы мақсатты гендер мен төмен концентрациялы мақсатты гендер бір мезгілде күшейтілген кезде бұл мәселеге назар аудару керек.
Мәселелер мен шешімдерЖалпы айтқанда, qPCR жөндеу кезінде жиі кездесетін мәселелер келесі аспектілерге назар аударады:
·спецификалық емес күшейту
·Праймер концентрациясын таңдау қиын және праймер-димерлермен қиындықтар
· Жасыту температурасы дұрыс емес
·Қосымша құрылым күшейту тиімділігіне әсер етеді
спецификалық емес күшейту
спецификалық емес күшейтуорын алса, әдетте праймер дизайнының сәйкес келмейтіні қарастырылады, бірақ егер сіз праймерлерді өзгертуге асықпасаңыз, алдымен келесі әдістерді қолданып көруге болады (принцип де қоса берілген):
· Жасыту температурасын жоғарылатыңыз – әлсіз сутектік байланыстарды сақтауға қабілетсіз етуге тырысыңыз;
· Жасыту және ұзарту уақытын қысқарту – әлсіз сутегі байланыстарының мүмкіндігін азайту;
·Праймер концентрациясын азайту – артық праймерлердің және мақсатты емес аймақтардың байланысу мүмкіндігін азайту;
Төмен күшейту тиімділігі
Арнайы емес күшейтуге қарама-қарсы жағдай – күшейтудің төмен тиімділігі және төмен күшейту тиімділігімен күресу шаралары керісінше:
· Жасыту және ұзарту уақытын ұзарту;
·Үш сатылы ПТР-ге ауысу және күйдіру температурасын төмендету;
·Праймер концентрациясын жоғарылату;
Ps: 90-шы жылдары туылған көптеген аспиранттар эксперименттерді қалай түзетуге болатынын зерттегісі келмейді және жинақ мәселені толығымен шеше алады деп үміттенеді (егер сіз оқуды бітіргеннен кейін зерттеу және тәжірибелік-конструкторлық жұмыстарды жүргізу үшін реагент компаниясына барғыңыз келсе), шын мәнінде, реагент өндірушілер де осылай ойлайды, бұл ақымақтық деп үміттенемін. әлсіз Н-байланысты сіңіру факторларын енгізу.Мәселені оңай шешу үшін ақымақтар әлі де әлсіз сутегі байланыстарын сіңіретін фактордың бар-жоғын білу үшін реагент компаниясының кіріспесін оқуы керек.
Праймер концентрациясын таңдау қиын және праймер-димерлермен қиындықтар
1-әдіс: Жалпы айтқанда, qPCR жинақ нұсқауларында ұсынылған жүйелер мен ұсынылған праймер концентрациялары бар.
2-әдіс: Праймер концентрациясының градиентін орнату арқылы жөндеу.Төмендегі суретті көрсету үшін компаниядан ұрланған.Төмендегі суретте үш праймер концентрациясы градиенті (100nM, 250nM, 500nM) және төрт үлгі концентрация градиенті (0,1ng, 1ng, 10ng, 100ng) арқылы жасалған флуоресценцияның сандық нәтижелері көрсетілген.Тәжірибе нәтижелерінің Ct мәні келесідей сызылады:

Праймер концентрациясын таңдау Әрбір праймер концентрациясын келесідей сызыққа біріктіріңіз:

Праймер концентрациясын таңдау айқын, 100нМ және 250нМ праймер концентрациясының сызықтық байланысы жақсырақ, ал 500нМ праймер концентрациясының сызықтық байланысы салыстырмалы түрде нашар.100нМ және 250нМ-де 250нМ Ct мәні салыстырмалы түрде аз, сондықтан праймердің оңтайлы концентрациясы 250нМ болады.Балқу қисығында әдетте ауыр праймер-димерлер көрінеді.Егер жобаланған праймерлер праймер-димерлерден аулақ бола алмаса ше?
3-әдіс: Праймерлердің мөлшерін азайтыңыз және жасыту температурасын арттырыңыз (түсіндірудің қажеті жоқ).
Жасыту температурасының эмпирикалық мәні 60°С.Егер сенімді болмасаңыз, неғұрлым қолайлы күйдіру температурасын қалай таңдауға болады?Жауап праймер концентрациясын таңдаумен бірдей -градиент сынағы.Мәселені суреттеу үшін Bio-rad компаниясынан суретке түсіріңіз.Белгілі бір мақсатты фрагментті күшейту үшін әрқайсысы үш қайталанатын сегіз температура градиентін орнатыңыз және алынған күшейту қисығы келесідей:

күйдіру температурасын таңдау:
·70°C, 69°C—Негізінде праймерлерді біріктіру мүмкін емес, сондықтан күшейту болмайды.
·67,3°C – Бастапқыда күшейтудің аз мөлшері бар, ал Ct мәні салыстырмалы түрде үлкен.
·64,5°C——Ct мәні төмендейді.
·60,7°C, 58,0°C, 56,2°C және 55,0°C температурада Ct мәндері негізінен тұрақты болды, бірақ соңғы флуоресценция мәндері әртүрлі болды.
Қалай таңдау керек?Принцип: Бірінші принцип - жоғары Ct мәні.Бірдей Ct мәні үшін димеризацияны және спецификалық емес күшейтуді болдырмау үшін жоғары күйдіру температурасын таңдаңыз.55 ° C температурада жоғары флуоресценция мәні бар болса да, онда димерлер немесе спецификалық емес күшейту болуы мүмкін.
Бірақ егер сіз өзіңіз сияқты ақылды болсаңыз, сіз міндетті түрде ойлайсыз: логикалық тұрғыдан алғанда, ПТР реакциясы өте ерекше болса, праймер концентрациясы ең төменгі талаптан асып кетсе, флуоресцентті бояулар мен dNTPs сияқты жоғары және төменгі нүктелер ешқандай әсер етпеуі керек.Шынында да, жасыту температурасы дұрыс оңтайландырылған кезде, праймер концентрациясының Ct мәніне әсері табиғи түрде азаяды.

Жасыту температурасы дұрыс оңтайландырылған және праймер концентрациясының КТ-ға әсері барынша азайтылады
Екіншілік құрылым күшейту тиімділігіне әсер етеді
Мәселені суреттеу үшін Bio-rad-тан суретті алайық.Ол сонымен қатар қайталама құрылымы бар генді күшейту үшін температура градиентін жобалайды.

Екіншілік құрылым пайда болады
Температура градиенті төмендеген сайын өнімдер пайда бола бастайтынын және Ct мәні алға жылжып, 60,7°С-та минималды мәнге жететінін, содан кейін температура градиенті төмендеген сайын Ct мәні үлкейетінін көруге болады.Керісінше, температура жоғарылаған сайын екінші құрылым ашылады және күшейту тиімділігі артады.Белгілі бір температураға жеткеннен кейін температураны арттыру күшейту тиімділігін жақсарта алмайды.Өйткені қазіргі уақытта праймерлерді тұрақты түрде біріктіру мүмкін емес.Сондықтан,ең төменгі Ct мәні бар температураны іздеңіз, бұл қайталама құрылым үлгісін күшейту үшін ең жақсы температура!Әрине, ақылды ақымақтар қажет болмаса, праймерлерді өзгерту және қайталама құрылым аймағынан аулақ болу жақсы екенін білуі керек.
5. Қолдану деңгейі
MIQE — деректерді талдау

Деректерді талдау негізінен флуоресцентті сандық ПТР құралымен беріледі.Алдыңғы мақалада экспериментті жобалауда түсіндірілетін бос бақылау сияқты көптеген деректерді талдау жұмыстары жүргізілді.Ішкі анықтамалық гендер, қайталанатын сандар және т.б. нақтыланды., мұнда біз негізінен qPCR қолдануын түсіндіреміз.
qPCR кеңінен қолданылады және тәжірибелік тексеру және нуклеин қышқылын диагностикалау ең жиі қолданылатын сценарийлер болып табылады.
абсолютті мөлшерлеу
Журнал (бастапқы концентрация) циклдар санымен сызықтық қатынасқа ие.Белгілі бастапқы көшірме нөмірі бар стандарттан стандартты қисық сызуға болады, яғни күшейту реакциясының сызықтық байланысын алуға болады.Үлгінің Ct мәніне сәйкес үлгідегі концентрацияны есептеуге болады.Қосылатын үлгілердің саны.

Абсолютті сандық есептеу әдісі
Абсолютті мөлшерлеу стандартты қисыққа негізделуі керек.Стандартты қисық жасау үшін стандарт қажет.Әдетте, стандарт мақсатты генді клондау арқылы алынған плазмид болып табылады.Неліктен бұл плазмида?Өйткені дөңгелек плазмидті ДНҚ ең тұрақты болып табылады.Стандартты өнімді 5-6 градиентпен қосарлану қатынасына (10 есе сұйылту) сәйкес сұйылтыңыз және сұйылту кезінде біркелкілікке назар аударыңыз.Ct мәні 15-30 аралығында болсын.

Стандартты дайындық
Бұл ретте сыналатын үлгіні де сәйкесінше сұйылту керек (сұйылту коэффициентін есте сақтаңыз), Ct мәні де 15-30 аралығында болуы керек.Стандартты өнім + сыналатын үлгі бірге машинаға қойылады.Жүгіруден кейін стандартты затпен стандартты қисық сызық жасалды және концентрацияны есептеу үшін сыналатын үлгілер стандартты қисыққа келтірілді.
В гепатиті вирусының HBV сандық көрсеткіші 1 мл қандағы вирустың көшірме санын есептей алатын типтік абсолютті сандық көрсеткіш болып табылады.
Көшірме нөмірін есептеу
Сыналатын үлгі концентрациясы (нг/ул) = OD260 × 50г/мл × сұйылту коэффициенті
Үлгінің молекулалық салмағы = негіздер саны × 324
Сыналатын үлгінің көшірме нөмірі (көшірмелер/ul) = сыналатын үлгінің концентрациясы / үлгінің молекулалық салмағы × 6 × 1014

Көшірме нөмірін есептеу әдісі

Жоғарыда аталған мөлшерді анықтауға арналған есептеу әдісі.Бұл орта мектепті бітіргеннен кейін шешілетін математикалық есеп, ал математикалық есептерді негізінен компьютерлер шешеді.Түсінбесеңіз, хабарласуға болады.
салыстырмалы мөлшерлеу
Салыстырмалы мөлшерлеу негізінен ғылыми зерттеулерде қолданылады.1мл қанда қанша вирус бар және бұл ДНҚ вирусы, бұл салыстырмалы түрде детерминирленген оқиға: қанның мөлшерін анықтауға болады, ал ДНҚ вирусы салыстырмалы түрде тұрақты.Бірақ жапырақтағы белгілі бір геннің транскрипциялық көшірмелерінің санын салыстыру бізге қиын, өйткені жапырақтың өлшемін, салмағын және нәзіктігін анықтау қиын, алынған РНҚ мөлшерін анықтау қиын, ал кері транскрипцияның тиімділігін анықтау да қиын , яғни кез келген қадам эксперименттік деректерде қателер болуы мүмкін және оны пайдалану мүмкін емес.
Сондықтан салыстырмалы мөлшерлеу элементті енгізуі керек:ішкі анықтамалық ген.
Басқаша айтқанда, салыстырмалы сандық анықтау шын мәнінде мақсатты ген мен ішкі анықтамалық ген арасындағы салыстыру болып табылады.Бір тінде және бір жасушада салыстырғанда үлгі өлшемі, РНҚ экстракция мөлшері, кері транскрипция тиімділігі және ПТР тиімділігі салыстырмалы түрде аз.Үлгі көлемінің аздығына байланысты ішкі анықтамалық гендер де, мақсатты гендер де салыстырмалы түрде қысқарды.Сондықтан біз бұрын да біркелкілік пен тұрақтылыққа баса назар аудардық.
Ішкі анықтамалық гендер әдеттешаруашылық гендер(тұрмыстық гендер), олар барлық жасушаларда тұрақты экспрессияланатын гендер класына жатады және олардың өнімдері жасушалардың негізгі тіршілік әрекетін сақтау үшін қажет.
Бұл тұжырымдаманы шатастырмаңыз.Тұрмыстық гендер биологиялық функция терминдері, ал ішкі анықтамалық гендер эксперименттік техникалық терминдер.Үй шаруашылығы гендері ішкі анықтамалық гендер ретінде таңдалмас бұрын валидациядан өтуі керек.
Мысалы, біз әртүрлі тін жасушаларында олардың экспрессия деңгейлерін тексеру үшін төмендегі суретте бірнеше шаруашылық гендерін таңдадық және β-2-микроглобулиннің экспрессия деңгейлері басқа үш геннің экспрессия деңгейлерінен айтарлықтай ерекшеленетінін анықтадық, сондықтан оларды ішкі анықтамалық гендер ретінде пайдалануға болмайды.

Ішкі референттік геннің түзету функциясын түсінгеннен кейін ішкі референттік геннің енгізілуіне байланысты екі алгоритм шығарылады.
·қос стандартты қисық әдісі
·2 – △△Ct әдісі (КТ мәнін салыстыру әдісі)
Егер сіз түрлер мен гендік функцияларды зерттеуге қызығушылық танытсаңыз, алгоритмдер бойынша зерттеулерден бас тартып, формулаларды тікелей пайдаланыңыз немесе тікелей машиналарды пайдаланыңыз;егер сіз математика және инженерия саласында түзу жігіт болсаңыз, еркін болыңыз.
қос стандартты қисық әдісі
Бақылау үлгісінің мақсатты генін және шаруашылық генін және стандартты қисық арқылы тексерілетін үлгіні сандық түрде анықтаңыз, содан кейін салыстырмалы өрнек деңгейі болып табылатын есептеу формуласына сәйкес салыстырмалы мәнді есептеңіз.
Артықшылықтары: қарапайым талдау, салыстырмалы қарапайым эксперименттік оңтайландыру
Кемшілігі: Әрбір ген үшін эксперименттердің әрбір раунды стандартты қисық жасауы керек
Қолданылуы: Ген экспрессиясын реттеуді зерттеуде ең жиі қолданылатын және танылған салыстырмалы сандық әдістердің бірі.
Формула келесідей:

Мысалдар төмендегідей:

Сандық нәтижеге негізделген салыстырмалы соманы есептеңіз
2 – △△Ct әдісі (КТ мәнін салыстыру әдісі)

Артықшылықтары: Стандартты қисық жасаудың қажеті жоқ
Кемшіліктері: Күшейтудің тиімділігі 100%-ға жақын деп есептеледі;стандартты ауытқу < 5% және стандартты қисық және әрбір күшейту арасындағы тиімділік сәйкес деп қабылданады;эксперименттік жағдайларды оңтайландыру күрделірек.
Қолданылуы: Ген экспрессиясын реттеуді зерттеуде ең жиі қолданылатын және танылған салыстырмалы сандық әдістердің бірі.

Әрине, күшейту тиімділігі әдетте мінсіз 1 болуы мүмкін емес. Түзету әдісі: Егер мақсатты ген мен анықтамалық геннің күшейту тиімділігі бірдей екенін білсек, бірақ күшейту тиімділігі 1-ге тең болмаса, онда 2－△△Ct келесідей түзетілуі мүмкін: (1+E )－△△Ct, мысалы, ампл5 формуласы дұрыс болса, тиімділік ампл9c болса. дейін 1,95－△△Ct
Осы уақытқа дейін флуоресцентті сандық ПТР туралы мазмұн аяқталды.