Cell Direct RT qPCR жинағы—SYBR GREEN I Тікелей жасуша лизисі жасушаға дайын бір қадамдық qRT-PCR жинақтары
Сипаттамалар
Бұл жинақта RT-qPCR реакциялары үшін өсірілген жасуша үлгілерінен РНҚ-ны жылдам босатуға мүмкіндік беретін бірегей лизис буферлік жүйесін пайдаланады, осылайша көп уақытты қажет ететін және көп күш жұмсайтын РНҚ тазарту процесін жояды.РНҚ үлгісін небәрі 7 минутта алуға болады.5×Тікелей RT араластыру және 2×Жинақпен қамтамасыз етілген тікелей qPCR Mix-SYBR реагенттері нақты уақыттағы сандық ПТР нәтижелерін жылдам және тиімді түрде ала алады.
5×Тікелей RT араластыру және 2×Тікелей qPCR Mix-SYBR ингибиторларға төзімділікке ие және үлгілердің лизаты тікелей RT-qPCR үшін үлгі ретінде пайдаланылуы мүмкін.Бұл жинақта бірегей РНҚ жоғары аффинді Foregene кері транскриптазасы және ыстық D-Taq ДНҚ полимеразасы, dNTPs, MgCl бар.2, реакция буфері, ПТР оптимизаторы және тұрақтандырғыш.
Техникалық сипаттамалар
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Жинақтың құрамдас бөліктері
| I бөлім | Буфер CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Буфер ST | |
| II бөлім | ДНҚ өшіргіш |
| 5× Тікелей RT микс | |
| 2× Тікелей qPCR Mix-SYBR | |
| 50× ROX анықтамалық бояуы | |
| RNase жоқ ddH2O | |
| Нұсқаулар | |
Ерекшеліктер мен артықшылықтар
■Қарапайым және тиімді: Cell Direct RT технологиясымен РНҚ үлгілерін небәрі 7 минутта алуға болады.
■ Үлгіге сұраныс аз, 10 ұяшықты сынауға болады.
■ Жоғары өткізу қабілеттілігі: ол 384, 96, 24, 12, 6 шұңқырлы пластиналарда өсірілген жасушалардағы РНҚ-ны жылдам анықтай алады.
■ DNA Eraser босатылған геномдарды жылдам жоя алады, кейінгі эксперимент нәтижелеріне әсерді айтарлықтай азайтады.
■ Оңтайландырылған RT және qPCR жүйесі екі сатылы RT-PCR кері транскрипциясын тиімдірек етеді, ал ПТР нақтырақ және RT-qPCR реакция ингибиторларына төзімдірек етеді.
Жинақ қолданбасы
Қолдану аясы: өсірілген жасушалар.
- Үлгі лизисі арқылы шығарылған РНҚ: тек осы жинақтың RT-qPCR үлгісіне қолданылады.
- Жинақ келесі мақсаттарда пайдаланылуы мүмкін: ген экспрессиясын талдау, siRNA арқылы генді өшіру әсерін тексеру, дәрілік скрининг және т.б.
Диаграмма
Сақтау және сақтау мерзімі
Бұл жинақтың I бөлігін 4℃ температурада сақтау керек;II бөлікті -20℃ температурада сақтау керек.
Foregene Protease Plus II 4 температурада сақталуы керек℃, -20℃ температурада қатып қалмаңыз.
Реагент 2×Тікелей qPCR Mix-SYBR -20 температурада сақталуы керек℃қараңғыда;жиі пайдаланылса, оны 4-те де сақтауға болады℃ қысқа мерзімді сақтау үшін (10 күн ішінде пайдалану).
Нақты уақыттағы ПТР праймерін жобалау принциптері
Алға және кері праймер
Нақты уақыттағы ПТР үшін праймер дизайны өте маңызды.Праймерлер ПТР күшейтудің ерекшелігі мен тиімділігіне байланысты және келесі принциптерге сілтеме жасай отырып жобалануы мүмкін:
Праймер ұзындығы: 18-30б.
GC мазмұны: 40-60%.
Tm мәні: Primer 5 сияқты праймерді жобалау бағдарламалық құралы праймердің Tm мәнін бере алады.Жоғарғы және төменгі ағынды праймерлердің Tm мәндері мүмкіндігінше жақын болуы керек.Tm есептеу формуласын да қолдануға болады: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).ПТР жүргізген кезде, әдетте, жасыту температурасы ретінде праймер Tm мәнінен 5 °C төмен температура таңдалады (жасыту температурасының сәйкес жоғарылауы ПТР реакциясының ерекшелігін арттыруы мүмкін).
Праймерлер мен ПТР өнімдері:
Жобалық праймер ПТР күшейту өнімінің ұзындығы жақсырақ 100-150 бит.
Үлгінің қайталама құрылымдық аймағындағы дизайн праймерлерінен мүмкіндігінше аулақ болу керек.
Жоғарғы және төменгі ағынды праймерлердің 3′ ұштары арасында 2 немесе одан да көп қосымша негіздердің пайда болуына жол бермеңіз.
Primer 3′ терминал негізі 3 қосымша қатарынан G немесе C болуы мүмкін емес.
Праймерлердің өздері қосымша құрылымдарға ие бола алмайды, әйтпесе ПТР күшейтуге әсер ететін шаш қыстырғыш құрылымы пайда болады.
ATCG праймер тізбегінде мүмкіндігінше біркелкі таратылуы керек, ал 3′ терминалды негізді T ретінде болдырмау керек.
1-қосымша:Cell Direct RT-qPCR Kit құрамдастарының қосымша бумасы
1.Жасушаның лизисі ерітіндісі
|
| |||
| Жинақтың құрамдас бөліктері (24 ұңғыма лизис жүйесі / ұңғыма) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 Т | 500 Т | ||
| БөлімI | Буфер CL | 20 мл | 100 мл |
| Foregene Protease Plus II | 400 мкл | 1 мл × 2 | |
| Буфер ST | 1 мл × 2 | 10 мл | |
| БөлімII | ДНҚ өшіргіш | 400 мкл | 1 мл × 2 |
2.RT Микс
|
| |
| Жинақтың құрамдас бөліктері (20 мкл реакция жүйесі) | DRT-01011-B1 |
| 200 Т | |
| 5× Тікелей RT микс | 800 мкл |
| RNase жоқ ddH2O | 1,7 мл × 2 |
|
| ||
| Жинақтың құрамдас бөліктері (20 мкл реакция жүйесі) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 Т | 1000 Т | |
| 2× Тікелей qPCR Mix-SYBR | 1 мл × 2 | 1,7 мл × 6 |
| 50× ROX анықтамалық бояуы | 40 мкл | 200 мкл |
| RNase жоқ ddH2O | 1,7 мл | 10 мл |
Нұсқаулықтар:
