Escherichia coli O157:H7 Нуклеин қышқылын анықтау жинағы (ПТР флуоресцентті зонд әдісі)
Жинақ сипаттамасы:
Cat.No.FP102
Ол тамақ, жем, су сынамалары мен қоршаған орта сынамаларында E. coli O157:H7 жылдам анықтау және скрининг үшін қолданылады.
Сипаттамалар
Ол тамақ, жем, су үлгілері мен қоршаған орта сынамаларында E. coli O157:H7 жылдам анықтау және скрининг үшін қолданылады.
[Тестілеу принципі]Флуоресцентті ПТР технологиясының принципіне сәйкес арнайы праймерлер мен Taqman зондтары ішек таяқшасы O157: H7 спецификалық геніне арналған және ішек таяқшасы O157: H7 анықтауын жүзеге асыру үшін флуоресцентті ПТР құралымен анықталады, ДНҚ-ны сапалы анықтау.
Жинақ мазмұны
Ескертпе: ROX арна зонды кірмейді.
| Cқарсыластар | Техникалық сипаттама | Qбірлік |
| Буфер А | Түтік | 1 |
| Буфер В | Түтік | 1 |
| Оң бақылау | Түтік | 1 |
| Теріс бақылау | Түтік | 1 |
Күтілетін пайдалану
Ол үшін пайдаланылады тамақ, жем, су үлгілері мен қоршаған орта сынамаларында E. coli O157:H7 жылдам анықтау және скрининг.
Сақтау шарттары және жарамдылық мерзімі
Қараңғы жерде -20℃ температурада сақтаңыз және қайта-қайта мұздату мен ерітуге жол бермеңіз.
Жарамдылық мерзімі - 12айлар, ал шығарылған күні сыртқы қаптамада көрсетілген.
Құралдар мен шығыс материалдары
Флуоресцентті сандық ПТР құралы, тамшуыр пистолеті және сәйкес ұштар, құйынды шайқағыш, шағын центрифуга.
Қолданылуы
1. Үлгіні өңдеу
1.1 Үлгі түрі: Бұл жинақ тамақ, жем, су үлгілері және ішек таяқшасы O157:H7 ластанған деп күдіктенген басқа үлгілер үшін жарамды.Терең өңделген ет өнімдері, сусындар және құрамында пигменттері бар басқа заттар үшін флуоресценттік сигнал жинауға әсер етпеу үшін оларды шаю қажет.
1.2 Үлгіні өңдеу: Үлгіні дайындау, байыту мәдениеті және ішек таяқшасы O157: H7 оқшаулау үшін "GB 4789.10-2016 Азық-түлік қауіпсіздігі ұлттық стандарты Escherichia coli O157 тағамдық микробиологиялық сараптамасы: H7 сынағы" бөлімін қараңыз.
- Nнуклеин қышқылын алу
1,5 мл центрифуга түтігіне 20 мл байыту ерітіндісін алыңыз, 200 мкл микроб лизатын қосыңыз (қосымша жинақ қажет), 30 секунд құйыңыз, қысқа уақыт центрифугалаңыз және бір жаққа қойыңыз.
Ескерту: Лизаттан нуклеин қышқылын алу 10 минут ішінде аяқталуы керек және оны ұзақ уақыт сақтауға болмайды.
3. Нуклеин қышқылын күшейту
3.1 Қолдану үшін флуоресцентті сандық ПТР құралын қосыңыз.
Жинақтағы A буфері мен В буферін мұқият ерітіңіз және қысқа центрифугалаңыз.Әрбір ПТР реакция түтігіне 18 мкл А буферін және 2 мкл В буферін қосыңыз.Содан кейін ПТР реакция түтіктеріне теріс бақылаудың, алынған нуклеин қышқылының және оң бақылаудың әрқайсысына 5 мл қосыңыз, түтіктерді жабыңыз және қысқа уақыт центрифугалаңыз.
3.3 ПТР реакция түтігін флуоресцентті ПТР аппаратына тасымалдаңыз және күшейту эксперименттерін орындау үшін келесі процедураларды қолданыңыз: реакция жүйесі үшін 25 мл таңдаңыз, әр цикл үшін 60°C температурада флуоресценция сигналдарын жинаңыз және анықтау арнасы үшін FAM таңдаңыз.
| Қадам | Бағдарлама | Циклдар саны |
| 1 | 37℃ 5 мин | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 мин | 1 |
| 3 | 95°C 15с | 4 0 |
| 60℃ 30с (флуоресценцияны жинау) |
Проблемаларды талдауға арналған нұсқаулықтар
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
РНҚ-ны алу мүмкін емес немесе нуклеин қышқылының шығымы төмен
Қалпына келтіру тиімділігіне әсер ететін әдетте көптеген факторлар бар, мысалы: үлгі РНҚ мазмұны, жұмыс әдісі, элюция көлемі және т.б...
Жалпы себептерді талдау:
1.Мұзды ванна немесе жұмыс кезінде төмен температурада (4 ° C) центрифугалау.
Ұсыныс: бөлме температурасында (15-25 ° C) жұмыс, ешқашан мұз ваннасы және төмен температуралы центрифуга.
2. Үлгіні дұрыс сақтамау немесе үлгіні тым ұзақ сақтау.
Ұсыныс: Үлгілерді -80 ° C температурада сақтаңыз немесе сұйық азотта мұздатыңыз және мұздату-ерітуді қайталап қолданбаңыз;РНҚ экстракциясы үшін жаңадан жиналған үлгілерді қолдануға тырысыңыз.
3. Үлгі лизисі жеткіліксіз
Ұсыныс: Үлгі мен жұмыс ерітіндісінің (сызықтық акриламид) мұқият араластырылғанына және бөлме температурасында (15-25 ° C) 10 минут бойы инкубацияланғанына көз жеткізіңіз.
4. Элюент қате қосылды
Ұсыныс: тазарту бағанының мембранасының ортасына RNase-Free ddH2O қосылғанын тексеріңіз.
5. viRW2 буферіндегі сусыз этанолдың дұрыс емес көлемі
Ұсыныс: Нұсқауларды орындаңыз, жинақты қолданар алдында viRW2 буферіне сусыз этанолдың дұрыс көлемін қосыңыз және оларды жақсылап араластырыңыз.
6. Үлгіні дұрыс пайдаланбау.
Ұсыныс: 500 мкл буфер viRL үшін 200 мкл үлгі.Үлгі көлемінің шамадан тыс болуы РНҚ экстракция жылдамдығының төмендеуіне әкеледі.
7.Дұрыс емес элюция көлемі немесе толық емес элюция.
Ұсыныс: тазарту колоннасының элюент көлемі 30-50мкл;егер элюция әсері қанағаттанарлық болмаса, алдын ала қыздырылған RNase-Free ddH қосу ұсынылады.2O және бөлме температурасында орналастыру уақытын ұзарту, мысалы, 5-10 мин
8.Тазалау бағанасында viRW2 буферінде шаюдан кейін этанол қалдығы бар.
Ұсыныс: viRW2 буферінде шаюдан және 2 минут бойы бос түтік центрифугалаудан кейін этанол әлі де қалса, қалған этанолды толығымен жою үшін тазарту бағанасын бос түтік центрифугасынан кейін бөлме температурасында 5 минут қалдыруға болады.
Тазартылған РНҚ молекулаларының ыдырауы
Тазартылған РНҚ сапасы үлгіні сақтау, RNase ластануы және жұмыс істеу сияқты факторларға байланысты.
Жалпы себептерді талдау:
1.Жиналған үлгілер уақытында сақталмады.
Ұсыныс: Егер үлгі жиналғаннан кейін уақытында пайдаланылмаса, оны -80 ℃ немесе сұйық азотта дереу сақтаңыз.РНҚ молекулаларын экстракциялау үшін мүмкіндігінше жаңадан жиналған үлгілерді қолдануға тырысыңыз.
2.Жиналған үлгілер қайта-қайта мұздату және еріту болды.
Ұсыныс: Үлгіні жинау және сақтау кезінде қайталанатын мұздату мен ерітуден (бір реттен көп емес) аулақ болыңыз, әйтпесе нуклеин қышқылының шығымы төмендейді.
3.RNase операциялық бөлмеде енгізілді немесе бір рет қолданылатын қолғаптар, маскалар және т.б. киілмеді.
Ұсыныс: РНҚ молекулаларын экстракциялау тәжірибесін бөлек РНҚ операциялық бөлмесінде орындаған дұрыс және эксперименталды үстел эксперимент алдында тазаланады.Тәжірибе кезінде RNAse енгізуден туындаған РНҚ деградациясын болдырмау үшін бір рет қолданылатын қолғап пен маска киіңіз.
4. Пайдалану барысында реагент RNase арқылы ластанған.
Ұсыныс: Қатысты эксперименттер үшін жаңа вирустық РНҚ оқшаулау жинағымен ауыстырыңыз.
5. Центрифуга түтіктерінің, тамшуыр ұштарының, т.б. RNase ластануы. Ұсыныс: Центрифуга түтіктерінің, тамшуыр ұштарының және тамшуырлардың барлығында RNase жоқ екеніне көз жеткізіңіз.
Тазартылған РНҚ молекулалары төменгі ағындағы эксперименттерге әсер етті
Тазарту бағанымен тазартылған РНҚ молекулалары тұз иондары немесе белоктар тым көп болса, төменгі ағындағы тәжірибелерге әсер етеді, мысалы: кері транскрипция, Northern Blot және т.б..
1. Элюцияланған РНҚ молекулаларында тұз иондары қалды.
Ұсыныс: viRW2 буферіне сусыз этанолдың дұрыс көлемі қосылғанына көз жеткізіңіз және пайдалану нұсқауларындағы дұрыс центрифугалау жылдамдығына сәйкес тазарту бағанын екі рет жуыңыз; Егер әлі де тұз иондары қалса, тазарту бағанына viRW2 буферін қосып, оны бөлме температурасында 5 минутқа қалдыруға болады.Содан кейін тұз иондарының ластануын барынша жою үшін центрифугалауды орындаңыз
2. Элюцияланған РНҚ молекулаларында этанол қалды
Ұсыныс: тазарту бағандарының viRW2 буферімен шайылғанын растағаннан кейін, пайдалану нұсқауларындағы центрифуга жылдамдығына сәйкес бос түтік центрифугалауды орындаңыз.Егер этанол әлі қалса, қалған этанолды барынша алып тастау үшін бос түтік центрифугалаудан кейін оны бөлме температурасында 5 минутқа қалдыруға болады.
Нұсқаулықтар:
Вирустық РНҚ оқшаулау жинағы нұсқаулық
