Біз тәжірибелі өндірушіміз.Үлкен жеңілдікті Қытай жоғары сезімталдықты бір қадамды зонд Rt- үшін өз нарығының маңызды сертификаттарында көпшілікті жеңіп алды.QpcrV2 жинағы, Сапа - зауыт өмірі, Тұтынушының сұранысына назар аудару - компанияның өмір сүруі мен дамуының көзі, Біз адалдық пен адал жұмыс ұстанымын ұстанамыз, сіздің келуіңізді асыға күтеміз!
Біз тәжірибелі өндірушіміз.Өз нарығының маңызды сертификаттарында көпшілікті жеңіп алуҚытай Так ДНҚ полимеразасы, Qpcr, Біздің компания уәде береді: қолайлы бағалар, қысқа өндіріс уақыты және сатудан кейінгі қанағаттанарлық қызмет, біз сізді кез келген уақытта біздің зауытқа келуге шақырамыз.Енді бізбен бірге жағымды және ұзақ мерзімді бизнес болғанын қалаймыз!!!

Сипаттамалар

Бұл жинақта RT-qPCR реакциялары үшін өсірілген жасуша үлгілерінен РНҚ-ны жылдам босатуға мүмкіндік беретін бірегей лизис буферлік жүйесін пайдаланады, осылайша көп уақытты қажет ететін және көп күш жұмсайтын РНҚ тазарту процесін жояды.РНҚ үлгісін небәрі 7 минутта алуға болады.Жинақпен қамтамасыз етілген 5×Direct RT Mix және 2×Direct qPCR Mix-SYBR реагенттері нақты уақыттағы сандық ПТР нәтижелерін жылдам және тиімді түрде ала алады.

5×Direct RT Mix және 2×Direct qPCR Mix-SYBR ингибиторларға төзімділікке ие және үлгілердің лизаты тікелей RT-qPCR үшін үлгі ретінде пайдаланылуы мүмкін.Бұл жинақта бірегей РНҚ жоғары аффинді Foregene кері транскриптазасы және ыстық D-Taq ДНҚ полимеразасы, dNTPs, MgCl бар.₂, реакция буфері, ПТР оптимизаторы және тұрақтандырғыш.

Техникалық сипаттамалар

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Жинақтың құрамдас бөліктері

Ерекшеліктер мен артықшылықтар

■ Қарапайым және тиімді: Cell Direct RT технологиясының көмегімен РНҚ үлгілерін небәрі 7 минут ішінде алуға болады.

■ Үлгіге сұраныс аз, 10 ұяшықты сынауға болады.

■ Жоғары өткізу қабілеттілігі: ол 384, 96, 24, 12, 6 шұңқырлы пластиналарда өсірілген жасушалардағы РНҚ-ны жылдам анықтай алады.

■ DNA Eraser босатылған геномдарды жылдам жоя алады, кейінгі эксперимент нәтижелеріне әсерді айтарлықтай азайтады.

■ Оңтайландырылған RT және qPCR жүйесі екі сатылы RT-PCR кері транскрипциясын тиімдірек етеді, ал ПТР нақтырақ және RT-qPCR реакция ингибиторларына төзімдірек етеді.

Жинақ қолданбасы

Қолдану аясы: өсірілген жасушалар.

- Үлгі лизисі арқылы шығарылған РНҚ: тек осы жинақтың RT-qPCR үлгісіне қолданылады.

- Жинақ келесі мақсаттарда пайдаланылуы мүмкін: ген экспрессиясын талдау, siRNA арқылы генді өшіру әсерін тексеру, дәрілік скрининг және т.б.

Диаграмма

Сақтау және сақтау мерзімі

Бұл жинақтың I бөлігін 4℃ температурада сақтау керек;II бөлікті -20℃ температурада сақтау керек.

Foregene Protease Plus II 4℃ температурада сақталуы керек, -20 ℃ температурада қатып қалмаңыз.

2×Direct qPCR Mix-SYBR реагентін -20℃ температурада қараңғы жерде сақтау керек;жиі пайдаланылса, оны қысқа мерзімді сақтау үшін 4℃ температурада да сақтауға болады (10 күн ішінде пайдалану). Біз тәжірибелі өндірушіміз.Үлкен жеңілдікті Қытайдың жоғары сезімталдықты бір қадамды зонд Rt-Qpcr жинағы V2 үшін өз нарығының маңызды сертификаттарында көпшілікті жеңіп алу, Сапа - зауыт өмірі, Тұтынушының сұранысына назар аудару - компанияның өмір сүруі мен дамуының көзі, Біз адалдық пен адал жұмыс ұстанымын ұстанамыз, сіздің келуіңізді асыға күтеміз!
Үлкен жеңілдікҚытай Так ДНҚ полимеразасы, Qpcr, Біздің компания уәде береді: қолайлы бағалар, қысқа өндіріс уақыты және сатудан кейінгі қанағаттанарлық қызмет, біз сізді кез келген уақытта біздің зауытқа келуге шақырамыз.Енді бізбен бірге жағымды және ұзақ мерзімді бизнес болғанын қалаймыз!!!

QuickEасыTM Cell Direct RT-qПТР Kit -Тағмan

Cat.No.DRT-01021/01022

≤ 1000 000 ұяшықты пайдаланып тікелей RT-qPCR ұяшықтары үшін

Өнімді таныстыру

Бұл өнім RT-qPCR реакциялары үшін өсірілген жасуша үлгілерінен РНҚ-ны жылдам шығару үшін бірегей лизис буферлік жүйесін пайдаланады, бұл көп уақытты қажет ететін және көп еңбекті қажет ететін РНҚ тазарту процесін болдырмайды және 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman көмегімен қажетті РНҚ үлгісін алу үшін небәрі 7 минут қажет.

5× Direct RT Mix және 2× Direct qPCR Mix-Taqman ингибиторларға күшті төзімділікке ие және үлгі ретінде өлшенетін үлгі лизатының көмегімен тиімді кері айналдыруды және арнайы күшейтуді орындай алады.Реагент құрамында Foregene кері транскриптаза, ыстық D-Taq ДНҚ полимераза, dNTPs, MgCl бар.₂, Реакция буфері, ПТР оңтайландырғышы және тұрақтандырғыш, үлгілерді жылдам және оңай анықтау үшін лизис буферімен бірге пайдалануға болады және жоғары сезімталдық, ерекшелік және тұрақтылық сипаттамалары бар.

Өнімнің ерекшеліктері

Қарапайым, тиімді Cell Direct RT технологиясы, ол РНҚ үлгілерін алу үшін 7 минуттан аз уақытты алады.

Үлгіге қойылатын талаптар аз және тәжірибе үшін кем дегенде 10 өсірілген ұяшықты пайдалануға болады.

384, 96, 24, 12 және 6 шұңқырлы пластиналар сияқты өсірілген жасушаларды жылдам РНҚ алу үшін жоғары өткізу қабілеті.

DNA Eraser босатылған геномдарды тез жоюға қабілетті, бұл кейінгі эксперименттік нәтижелерге әсер етуді айтарлықтай азайтады.

Оңтайландырылған RT және qPCR жүйелері кері транскрипциясы, спецификасы және RT-qPCR реакциясының ингибиторларына төзімділігі жоғарырақ екі сатылы RT-PCR мүмкіндігін береді.

Жинақ қолданбасы

Қолдану аясы: Өсімдік жасушалары.

Үлгі лизисі түсіндірілетін РНҚ: тек екі сатылы RT-qPCR үлгісі ретінде пайдаланылады.

Жинақтарды келесі мақсаттарда қолдануға болады: геннің реттегіш экспрессиясын талдау, аллельді сынау, дәрілік скрининг және т.б.

Жинақтың шектеулері

Күшейтілген фрагменттер ≤ 300 bp.

Жинақтар жасушаларды жаңадан өсіру үшін қолданылады.

Өнім сапасын бақылау

FOREGENE жалпы сапа менеджменті жүйесіне сәйкес, Cell Direct RT-qPCR сериялы жинақтарының әрбір партиясы жинақтардың әрбір партиясы сапасының сенімділігі мен тұрақтылығын қамтамасыз ету үшін бірнеше рет қатаң сынақтан өтеді.

Жинақтың мазмұны

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman бөлек сатып алуға болады, мәліметтер 1-қосымшада берілген (13-БЕТ).

Сақтау шарттары

1. Жеткізу шарттары

Жинақтың <4 °C күйінде болуын қамтамасыз ету үшін төмен температурадағы мұз қаптамасының қорапшасын тасымалдаудың бүкіл процесі.

2. Сақтау шарттары

I бөлігін 4°C және II бөлігін -20°C температурада сақтаңыз.

Foregene Protease Plus II -20°C мұздатылған емес, 4°C температурада сақталуы керек.

Реагент 2× Direct qPCR Mix-Taqman -20°C температурада немесе жиі пайдаланылса (10 күн ішінде) қысқа мерзімді пайдалану үшін 4°C температурада сақталады.

Жинақ құрамдас ақпараты

CL буфері: жасуша лизисі реакциялары үшін қажетті ортаны қамтамасыз етеді.

Буфер ST: кейінгі RT әсерлерін болдырмау үшін лизаттағы белсенді затты тоқтатады.

DNA Eraser: ДНҚ кетіргіш, геномды жоюдың кейінгі эксперименттерге әсері.

5× Тікелей RT микс: жоғары РНҚ ұқсастығы Foregene кері транскриптазасы, RNase тежегіші, dNTPs, тұрақтандырғыштар, күшейткіштер, оптимизаторлар және оңтайлы туралау үшін кері транскрипция праймерлері (Random Primer, Oligo(dT))₁₈праймер).

Foregene Protease Plus II: лизис буферінің контекстінде жасушалар нуклеин қышқылдарын шығару үшін лизиденеді.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Бұл реагентте ыстық D-Taq ДНҚ полимеразасы, dNTPs, MgCl бар₂, реакция буфері, ПТР оңтайландырғышы және тұрақтандырғыш.

20× ROX анықтамалық бояуы: әдетте ABI, Stratagene және басқа компаниялардың нақты уақыттағы ПТР күшейту құралдарында қолданылады, ол ПТР дозалау қателерінен туындаған ПТР түтіктері мен түтіктер арасындағы айырмашылықты реттеу үшін қолданылады.Әртүрлі құралдар үшін қажетті 20× ROX анықтамалық бояу концентрациясы әртүрлі және пайдаланушы оны құралдың ұсынылған концентрациясына сәйкес қоса алады.

RNase жоқ ddH₂O: екі сатылы RT-qPCR реакциялары үшін RNase жоқ зарарсыздандырылған ультра таза су.

Сақтық шаралары:(Жинақты қолданар алдында сақтық шараларын мұқият оқып шығыңыз)

Үлгілер арасында айқаспалы ластануды болдырмау үшін эксперименттің жұмыс әдісіне назар аударыңыз.

RNase ластануын және РНҚ деградациясын болдырмау үшін тәжірибе ортасының және ыдыстардың тазалығына назар аударыңыз.

Жаңа немесе жақсы сақталған жасуша үлгілерін алыңыз және қайталанатын мұздатылған еріген жасуша үлгілерін ешқашан пайдаланбаңыз.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman қайталанатын мұздату-ерітуден аулақ болу керек, әйтпесе ол кері транскрипцияға және ПТР тиімділігіне әсер етеді.

Дайындықрациондарбұрыноперация

Бұл жинақты қолданар алдында нұсқауларды мұқият оқып шығыңыз.Cell Direct RT-qPCR жинағы қарапайым, ыңғайлы және жылдам жұмыс істейді және нұсқаулар бүкіл жинақ және оны қалай дұрыс пайдалану керектігі туралы толық ақпаратты береді.Қолданар алдында қажетті эксперименттік материалдар мен жабдықтарды дайындаңыз.

Эксперименттік материалдар мен жабдықтар

◆ Мәдениет жасушалары.

◆ 1,5 мл немесе 2 мл, RNase-/DNase-Free центрифуга түтігі, RNase-/DNase-Free ұшы, 0,2 мл стерильді qPCR түтігі.

◆ qPCR машинасы, тамшуыр, үстел үсті центрифугасы (≥13 400×ж) (эксперименттік қажеттіліктерге байланысты) т.б.

Қауіпсіздік

◆ Бұл өнім тек ғылыми зерттеу мақсаттарына арналған, оны фармацевтикалық, клиникалық, тағамдық және косметикалық мақсаттарда қолданбаңыз.

◆ Химиялық заттарды пайдаланған кезде тиісті зертханалық киім, қолғап, қорғаныш көзілдірік, т.б. киіңіз.

Операциябағыттаушылар

Жасуша лизисі жүйелерін, RT жүйелерін және qPCR реакциясы ерітіндісінің қосымша бумаларын 1-қосымшада (13-БЕТ) мәліметтер алу үшін бөлек сатып алуға болады.

Жұмыс нұсқаулығы

A: РНҚ шығару үлгісі

1.Жасушалар алдын ала өңделді: Жасуша культурасының пластинасын салқын PBS көмегімен жуыңыз, содан кейін жасушаларды лизиздеңіз (10-10⁶), 10⁶ РНҚ экстракциясы мен тазарту үшін жасушаның жалпы РНҚ оқшаулау жинағын (DE-03111) немесе жануарлардың жалпы РНҚ оқшаулау жинағын (DE-03011) шығару ұсынылады.

1.1.Жабысқақ жасушалар (мысал ретінде 24 шұңқырлы пластина)

1.1.1.Әрбір шұңқырдағы ұяшықтардың санын анықтаңыз, ұяшықтар саны 1 × 10 екенін анықтаңыз⁵, және культуралық ыдыстан қоректік ортаны алу үшін тамшуырды пайдаланыңыз.

1.1.2.Әрбір ұңғымаға 200 мкл алдын ала салқындатылған 1 × PBS қосыңыз.Қайталап тамшуырламаңыз және ұңғымалардан PBS алып тастамаңыз.Пластинаны еңкейтіп, мүмкіндігінше көп PBS алып тастаңыз.2-қадамға өтіңіз.

1.1.3.Жасуша культурасына арналған әртүрлі ыдысқа немесе жасуша культурасына арналған ыдыстағы 1-1 анықтамалық нөмір кестесіне жасушаларды жуу үшін алдын ала салқындатылған 1 × PBS қосылды.

Кесте 1-1: әртүрлі жасушалар саны үшін PBS дозасы

Ескерту:Бекітілген жасушаларды қамтамасыз ету，жуу кезінде жасушалардың жоғалуын болдырмайды.

1.2.Кеуекті емес пластиналарда өсірілген суспензия жасушалары немесе жабысқақ жасушалар

1.2.1.Көп шұңқырлы емес пластиналарда өсірілген адгерентті жасушалар (суспензия жасушалары келесі қадам 1.2.2-ден басталады), жасушаларды қалыпты жасуша жинау әдісіне сәйкес жинап, ажыратады және культуралық пластинаға немесе центрифугалық түтікке орналастырады;егер трипсинизация қолданылса, жасушаларды жинау және қалдық трипсинді жою үшін центрифугалау қажет, жасушаларды тарату үшін PBS қайта суспензияланған жасушалар жеке жасушаларға қосылды.

1.2.2.Ұяшықтар саны есептеліп болғаннан кейін 1×10 ұяшықтарға бөлінген⁵ біреуін түтіктерді центрифугалау үшін, 1000 × г центрифугалау арқылы жасушаларды 10 минут бойы жинаңыз.

1.2.3.Центрифуга түтігіне 200 мкл PBS қосыңыз, қайталап тамшуырламаңыз және PBS тікелей сорып алыңыз.2-қадамға өтіңіз. (Егер тұнбаға түсу қиын болса және жасушалар қайтадан суспензияланса, үстіңгі затты тастағаннан кейін 10 минуттан кейін 1000 × г центрифугалауға болады, жасуша түйіршіктері 2-қадамға өтеді)

2.Жасуша лизисі: Бөлме температурасына теңестірілген CL буферін, DNA Eraser және Foregene Protease Plus II келесі кесте 1-2 дайындалған лизис жүйесіне сәйкес алып тастаңыз: (Лизис ерітіндісі пайдалануға дайын).

Кесте 1-2: бөліну жүйені дайындау (Ескерту: мұздағы дайындықта)

3.( Мысал ретінде 24-шұңқырлы пластинка) Әрбір ұңғымаға 200 мкл жасуша лизисі негізгі қоспасын тамызыңыз, 5-10 рет қайталап үрлеңіз, бөлме температурасында (20-25 ℃) 5 минут инкубациялаңыз.

Ескерту:Көпіршіктердің пайда болуын болдырмас үшін тамшуырлар шкаласын 200 мкл немесе одан аз етіп реттеген кезде өтінеміз.Лизистен кейін жасушалар бұлыңғыр болып көрінуі мүмкін, бұл қалыпты жағдай.

4. (Мысал ретінде 24 шұңқырлы пластина) сұйықтыққа 20 мкл буфер ST қосылады (1-3-кестеде көрсетілген мөлшерде қосылған әртүрлі лизистік жүйелер буфері ST), 5-10 рет қайталап тамшуырлау, бөлме температурасында (20-25 ℃) 2 минут инкубацияланды.

Ескерту:Тамшуыр ұшы лизаттың қосылғанын қамтамасыз етіп, бетінің астына орналастырылды，көпіршіктердің пайда болуын болдырмау үшін тамшуырлар шкаласын 200 мкл немесе одан аз етіп реттегенде өтінеміз.

Кесте 1-3:ST буферін қосыңыз

5. Лизат келесі RT-qPCR тәжірибелері үшін пайдаланылады.Егер келесі тәжірибелерді уақытында орындау мүмкін болмаса, оны мұзда 2 сағаттан артық емес ұстаңыз және -20℃ немесе -80 ℃ температурада (үш айдан аспайтын) сақтаңыз.

B: RT жүйесін дайындау

1.5 × Direct RT Mix алыңыз және оны мұз ваннасына қойыңыз, табиғи түрде еріп, кейінірек пайдалану үшін ақырын араластырыңыз;RNase-Free ddH2O алыңыз және оны балқытып, кейінірек пайдалану үшін мұз ваннасына қойыңыз.Төмендегі 2-1 кестеге сәйкес мұздағы реакция жүйесін дайындаңыз.

Кесте 2-1: RT реакция жүйесін дайындау

2. Жүйені құрастыру аяқталғаннан кейін, ақырын араластырыңыз және келесі кестеде қысқаша центрифугадан өткізіңіз 2 -2 реакция шарттары RT реакциясы.

Кесте 2-2: RT Реакция күйінің параметрі

3. Реакция аяқталғаннан кейін реакция өнімі qPCR үшін тікелей мұзға қойылды, ұзақ мерзімді сақтау -20℃ немесе -80 ℃ қойыңыз.

Ескертпе: Тазартылмаған үлгіні пайдаланғандықтан, кері транскрипция өнімінде ақ тұнбалар пайда болуы мүмкін.Бұл қалыпты құбылыс.Кейінгі тәжірибелер үшін үстіңгі затты дереу центрифугалаңыз.

Алынған RT реакция ерітіндісі келесі қадамдық нақты уақыттағы ПТР реакция жүйелеріне қосылады, реакция жүйесінің 10-30% аралығындағы мөлшерді қосу ұсынылады.

C: qPCR реакция жүйесін дайындау

1. Реакция жүйесін дайындау үшін келесі 3-1 кестеге сәйкес cDNA үлгісінің қадамында дайындалған B тиісті мөлшері.

Ескертпе: cDNA үлгісінің мөлшері qPCR жүйесінің 10-30% құрайды.Мысалы, 20 мкл qPCR жүйесінде 2-6 мкл лизис буферін қосыңыз, бірақ 6 мкл артық емес.

2. qPCR реакциясы үшін оңтайландырудың жақсы qPCR шарттары (Қызу температурасы, т.б.) (реакция шарттары 3-2 кестеде берілген).

Ескертпе: Жақсырақ нәтиже алу үшін qPCR реакциялары үшін оңтайландырылған шарттарды пайдаланып көріңіз.

Кесте 3-1: ПТР реакция жүйесін дайындау

1*: праймер реакциясының өнімділігі нашар болған кезде праймер концентрациясын 50-900 нМ диапазонында реттеуге болады.

Ескертпе: qPCR жүйесін эксперименттік қажеттіліктерге және флуоресценция циклінің үлгісіне сәйкес реттеуге болады.50-де qPCR үшінμl жүйесінде реагент дозасын 20-ға сәйкес пропорционалды түрде реттеңізμl жүйесі.

2*: Флуоресценцияның сандық термиялық цикліне сәйкес ROX Reference Dye сәйкес соңғы концентрациясын таңдаңыз.Кәдімгі флуоресценциялық сандық циклерлер үшін ең қолайлы ROX анықтамалық бояу концентрациялары төмендегі кестеде көрсетілген:

Кесте 3-2: qPCR реакция шарттары берілген

Ескертпе: Ең жақсы qPCR әсерін алу үшін градиенттік ПТР әртүрлі үлгілер мен әртүрлі праймерлер үшін реакция шарттарын оңтайландыру үшін пайдаланылуы мүмкін.ПТР реакциясының шарттары флуоресценция анализаторына, шаблонға, праймерге және т.б. байланысты өзгереді. Арнайы операцияда оңтайлы реакция жағдайлары флуоресценцияның сандық термиялық циклінің нақты шарттарына, шаблон түріне, қызықтыратын фрагмент өлшеміне, күшейтілген фрагменттің базалық ретіне және GC мазмұнына және күйдіру температурасын қоса алғанда, праймерлердің ұзақтығына және т.б.

Нақты уақыттағы ПТР праймерін жобалау принциптері

Алға және кері праймер

Нақты уақыттағы ПТР үшін праймер дизайны өте маңызды.Праймерлер ПТР күшейтудің ерекшелігі мен тиімділігіне байланысты және келесі принциптерге сілтеме жасай отырып жобалануы мүмкін:

◆ Праймер ұзындығы: 18-30bp.

◆ GC мазмұны: 40-60%.

◆ Tm мәні: Primer 5 сияқты праймерді жобалау бағдарламалық құралы праймердің Tm мәнін бере алады.Жоғарғы және төменгі ағынды праймерлердің Tm мәндері мүмкіндігінше жақын болуы керек.Tm есептеу формуласын да қолдануға болады: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).ПТР жүргізген кезде, әдетте, жасыту температурасы ретінде праймер Tm мәнінен 5 °C төмен температура таңдалады (жасыту температурасының сәйкес жоғарылауы ПТР реакциясының ерекшелігін арттыруы мүмкін).

◆ Праймерлер мен ПТР өнімдері:

◆ Дизайн праймерінің ПТР күшейту өнімінің ұзындығы жақсырақ 100-150 бит.

◆ Үлгінің қосалқы құрылымдық аймағындағы дизайн праймерлерінен мүмкіндігінше аулақ болу керек.

◆ Жоғарғы және төменгі ағынды праймерлердің 3′ ұштары арасында 2 немесе одан да көп қосымша негіздердің пайда болуына жол бермеңіз.

◆ Primer 3′ терминал негізі 3 қосымша қатарынан G немесе C болуы мүмкін емес.

◆ Праймерлердің өздері қосымша құрылымдарға ие бола алмайды, әйтпесе ПТР күшейтуге әсер ететін шаш қыстырғыш құрылымы пайда болады.

◆ ATCG праймер тізбегінде мүмкіндігінше біркелкі бөлінуі керек, ал 3′ терминал негізін T ретінде болдырмау керек.

Қосымша1:CтікелейRT-qPCR Жинақ құрамдас бөлігіt қосымша пакет

1.Жасуша лизисі ерітіндісі