Орталық догмада РНҚ ДНҚ мен ақуыз экспрессиясы арасындағы транскрипциялық медиатор болып табылатыны белгілі.ДНҚ-ны анықтаумен салыстырғанда, РНҚ-ны анықтау организмдердегі геннің экспрессиясын объективті түрде көрсете алады.РНҚ қатысатын тәжірибелерге мыналар жатады: qRT-PCR, RNA-Seq және синтез генін анықтау және т.б. РНҚ-ның өзіне тән сипаттамалары негізінде (РНҚ-ның қант сақинасында ДНҚ-ның қант сақинасына қарағанда бір бос гидроксил тобы бар), қоршаған ортадағы РНҚ-лардың көп санымен байланысқан РНҚ ДНҚ-ға қарағанда тұрақсыз және ыдырауға оңай.Қоқыс ішке, қоқыс шығару, егер РНҚ сапасы жақсы болмаса, эксперимент нәтижелері қанағаттанарлықсыз болуы керек, нақты деректердің дәл еместігі немесе қайталану қабілетінің нашарлығы ретінде көрінуі керек.Сондықтан РНҚ өңдеуге көбірек көңіл бөлінуі керек, ал кейінгі тәжірибелік мәліметтердің дәлдігі мен дәлдігін қамтамасыз ету үшін сапаны бақылау байланысы да маңыздырақ.

РНҚ сапасын бақылау үшін әдетте келесі жиі қолданылатын әдістер бар:

• Спектрофотометрия
• агарозды гель электрофорезі
• Agilent биоанализер
• нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР
• Кубит флуоресцентті бояу әдісі

01 Спектрофотометрия

РНҚ конъюгацияланған қос байланысы бар және 260 нм толқын ұзындығында жұтылу шыңына ие.Ламберт-Беер заңы бойынша біз РНҚ концентрациясын 260 нм абсорбция шыңынан есептей аламыз.Сонымен қатар, біз РНҚ тазалығын 260нм, 280нм және 230нм абсорбция шыңдарының арақатынасына сәйкес есептей аламыз.280нм және 230нм сәйкесінше белоктар мен кіші молекулалардың сіңіру шыңдары болып табылады.Білікті РНҚ тазалығының A260/A280 және A260/A230 арақатынасы 2-ден жоғары болуы керек. Егер ол 2-ден аз болса, бұл РНҚ үлгісінде ақуыз немесе шағын молекулалық ластану бар екенін білдіреді және оны қайтадан тазарту қажет.Ластану көздері ПТР реакцияларының күшейту тиімділігін тежеу ​​сияқты төменгі тәжірибелерге әсер етіп, дәл емес сандық нәтижелерге әкеледі.РНҚ-ның тазалығы кейінгі нәтижелерге үлкен әсер етеді, сондықтан спектрофотометрия әдетте нуклеин қышқылы эксперименттерінің бірінші сатысында сапаны бақылаудың таптырмас буыны болып табылады.

Сурет 1. Типтік РНҚ/ДНҚ сіңіру спектрі

02 Агарозды гель электрофорезі

Тазалықтан басқа, РНҚ-ның тұтастығы да РНҚ сапасын бағалаудың маңызды көрсеткіштерінің бірі болып табылады.РНҚ-ның ыдырауы үлгідегі қысқа фрагменттердің үлкен санына әкеледі, сондықтан тиімді анықталатын және анықтамалық тізбекпен жабылатын РНҚ фрагменттерінің саны азаяды.РНҚ тұтастығын 1% агарозды гельде жалпы РНҚ электрофорезі арқылы тексеруге болады.Бұл әдіс гельді өзіңіз конфигурациялауға немесе тұтастығын тексеру үшін алдын ала дайындалған E-Gel™ жүйесін пайдалануға болады.Жалпы РНҚ-ның 80%-дан астамы рибосомалық РНҚ, оның көпшілігі 28S және 18S рРНҚ-дан тұрады (сүтқоректілер жүйесінде).Жақсы сапалы РНҚ екі айқын жарқын жолақты көрсетеді, олар сәйкесінше 5 Кб және 2 Кб-та 28S және 18S жарқын жолақтар болып табылады және арақатынас 2:1-ге жақын болады.Егер ол диффузиялық күйде болса, бұл РНҚ үлгісі деградацияланған болуы мүмкін дегенді білдіреді және РНҚ сапасын одан әрі тексеру үшін кейінірек сипатталған әдісті пайдалану ұсынылады.

Сурет 2. Агарозды гель электрофорезінде бұзылған (2-жол) және бүлінбеген РНҚ (3-жол) салыстыру

03 Agilent биоанализаторы

РНҚ тұтастығын оңай және жылдам анықтауға көмектесетін жоғарыда сипатталған агарозды гельді электрофорез әдісіне қоса, РНҚ тұтастығын анықтау үшін Agilent биоанализерін де пайдалана аламыз.Ол РНҚ концентрациясы мен тұтастығын бағалау үшін микрофлюидтердің, капиллярлық электрофорездің және флуоресценцияның комбинациясын пайдаланады.РНҚ үлгісінің профилін талдау үшін кірістірілген алгоритмді пайдалану арқылы Agilent биоанализаторы РНҚ тұтастығының анықтамалық мәнін, РНҚ тұтастық нөмірін (бұдан әрі - RIN) [1] есептей алады.RIN мәні неғұрлым үлкен болса, соғұрлым РНҚ-ның тұтастығы жоғары болады (1 - өте бұзылған, 10 - ең толық).РНҚ-ны қамтитын кейбір тәжірибелер сапаны бағалау үшін RIN параметрін пайдалануды ұсынады.Мысал ретінде жоғары өнімді секвенирлеу эксперименттерін (бұдан әрі - NGS) ала отырып, Thermo Fisher's Oncomine панелі сериясындағы B жасушалары мен Т-жасушаларының антиген рецепторларын анықтау үшін пайдаланылатын Oncomine™ Адамның иммундық репертуарының нұсқаулары RIN мәндері 4-тен жоғары үлгілерді оқуға және тиімдірек өлшеуге болатынын ұсынады.Әртүрлі панельдер үшін әртүрлі ұсынылған диапазондар бар және жиі жоғарырақ RIN тиімдірек деректерді әкелуі мүмкін.

3-сурет, Oncomine™ Human Immune Repertuire эксперименттерінде RIN 4-тен жоғары үлгілер тиімдірек оқуларды және Т жасушаларының клондарын анықтай алады.【2】

Дегенмен, RIN мәнінің де кейбір шектеулері бар.RIN NGS эксперименттік деректерінің сапасымен жоғары корреляцияға ие болғанымен, ол FFPE үлгілері үшін жарамсыз.FFPE үлгілері ұзақ уақыт бойы химиялық өңдеуден өтті және алынған РНҚ әдетте салыстырмалы түрде төмен RIN мәніне ие.Дегенмен, бұл эксперименттің тиімді деректері қанағаттанарлықсыз болуы керек дегенді білдірмейді.FFPE үлгілерінің сапасын дәл бағалау үшін RIN-ден басқа өлшемдерді пайдалану керек.RIN-ге қоса, Agilent биоанализаторы РНҚ сапасының бағалау параметрі ретінде DV200 мәнін де есептей алады.DV200 — РНҚ үлгісіндегі 200 bp-ден үлкен фрагменттердің үлесін есептейтін параметр.DV200 RIN үлгісіне қарағанда FFPE үлгісі сапасының жақсы көрсеткіші болып табылады.FFPE арқылы алынған РНҚ үшін ол тиімді анықталатын гендер санымен және гендердің әртүрлілігімен өте жоғары корреляцияға ие [3].DV200 FFPE сапасын анықтаудағы кемшіліктерді толтыра алатынына қарамастан, Agilent биоанализаторы РНҚ үлгілеріндегі сапа мәселелерін, соның ішінде үлгілерде ингибиторлардың бар-жоғын әлі де жан-жақты талдай алмайды.Ингибиторлардың өздері төменгі ағындағы эксперименттердің күшейту тиімділігіне әсер етіп, пайдалы деректер көлемін азайта алады.Үлгіде ингибитордың бар-жоғын білу үшін біз нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР әдісін қолдана аламыз.

04 нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР

Нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР әдісі үлгідегі ингибиторларды анықтап қана қоймай, сонымен қатар FFPE үлгісіндегі РНҚ сапасын дәл көрсете алады.Agilent биологиялық анализаторларымен салыстырғанда, нақты уақыттағы флуоресцентті сандық құралдар кеңірек қолданылуына байланысты ірі биологиялық зертханаларда көбірек танымал.РНҚ үлгілерінің сапасын тексеру үшін бізге тек GUSB (Cat № Hs00939627) сияқты ішкі анықтамалық гендер үшін праймер зондтарын сатып алу немесе дайындау керек.Абсолютті сандық эксперименттерді жүргізу үшін праймерлердің, зондтардың және эталондардың осы жинағын (белгілі концентрацияның жалпы РНҚ) пайдалану арқылы РНҚ фрагментінің тиімді концентрациясын РНҚ сапасының бағалау стандарты ретінде есептеуге болады (қысқаша Функционалды РНҚ мөлшері (FRQ)).NGS тестінде біз РНҚ үлгілерінің FRQ тиімді деректер көлемімен өте жоғары корреляцияға ие екенін анықтадық.0,2ng/uL FRQ-ден асатын барлық үлгілер үшін оқулардың кемінде 70%-ы анықтамалық тізбекті тиімді қамтуы мүмкін (4-сурет).

4-сурет, флуоресценциялық сандық әдіспен анықталған FRQ мәні NGS тәжірибесінде алынған тиімді деректермен өте жоғары корреляцияға ие (R2>0,9).Қызыл сызық 0,2 нг/уЛ (log10 = -0,7) тең FRQ мәні болып табылады.【4】

FFPE үлгілеріне қолданылуымен қатар, нақты уақыттағы сандық ПТР әдісі үлгілердегі тежегіштерді де тиімді бақылай алады.Біз анықталатын үлгіні ішкі оң бақылау (IPC) және оның талдауы бар реакция жүйесіне қосып, содан кейін Ct мәнін алу үшін флуоресценттік сандық анықтауды орындай аламыз.Сынамасыз реакциядағы Ct мәні Ct мәнінен артта қалса, бұл ингибитордың үлгіде бар екенін көрсетеді және реакциядағы күшейту тиімділігін тежейді.

05 Qubit флуоресцентті бояу әдісі

Qubit флюорометр - нуклеин қышқылының концентрациясы мен тазалығын анықтауға арналған ең жиі қолданылатын шағын құрылғы, оны басқару оңай және кез келген молекулалық биология зертханасында бар.Ол нуклеин қышқылының концентрациясын анықтау және нуклеин қышқылын байланыстыратын флуоресцентті бояу (Qubit анықтау реагенті) арқылы дәл есептейді.Qubit жоғары сезімталдық пен ерекшелікке ие және РНҚ-ны pg/µL концентрациясына дейін дәл сандай алады.Нуклеин қышқылының концентрациясын дәл анықтаудың белгілі қабілетінен басқа, Термо Фишердің соңғы жаңа моделі Qubit 4.0 да РНҚ тұтастығын анықтай алады.Qubit 4.0 RNA анықтау жүйесі (RNA IQ Assay) бір уақытта екі арнайы флуоресцентті бояуларды анықтау арқылы РНҚ тұтастығын анықтайды.Бұл екі флуоресцентті бояғыштар сәйкесінше РНҚ-ның үлкен фрагменттері мен шағын фрагменттерімен байланыса алады.Бұл екі флуоресцентті бояу үлгідегі РНҚ-ның үлкен фрагменттерінің үлесін көрсетеді және осыдан РНҚ сапасын білдіретін IQ (тұтастық және сапа) мәнін есептеуге болады.IQ мәні FFPE және FFPE емес үлгілерге де қолданылады және келесі реттілік сапасына үлкен әсер етеді.Мысал ретінде NGS эксперименттерін алатын болсақ, Ion torrent™ платформасында орындалған RNA-Seq сынақ эксперименттерінде IQ мәндері 4-тен жоғары үлгілердің көпшілігінде кемінде 50% тиімді оқу көрсеткіштері болды (5-сурет).Жоғарыда аталған анықтау әдістерімен салыстырғанда, Qubit IQ Assay жұмыс істеуге ыңғайлы және аз уақытты (бес минут ішінде) алып қана қоймайды, сонымен қатар өлшенген IQ параметрінің мәні мен төменгі ағындағы эксперименттердің деректер сапасы арасында үлкен корреляцияға ие.

5-сурет, Qubit RNA IQ мәні мен RNA-Seq салыстырылған оқулары арасында үлкен корреляция бар.【5】

Жоғарыда келтірілген кіріспе арқылы мен әркім әртүрлі РНҚ сапасын бақылау әдістерін жеткілікті түрде түсінеді деп есептеймін.Іс жүзінде сіз таңдай аласызүлгі түріне және қолданыстағы құралдарға сәйкес сәйкес әдіс.Тек РНҚ сапасын жақсы бақылау арқылы біз үлгі сапасының нашарлығынан кейінгі эксперименттердің сәтсіздігін болдырмауға болады, осылайша қымбат уақытты, энергияны және шығындарды үнемдей аламыз.

Анықтамалық өнімдер:

Жануарлардың жалпы РНҚ оқшаулау жинағы

Жасушаның жалпы РНҚ оқшаулау жинағы

сілтемелер

【1】Шредер, А., Мюллер, О., Стокер, С. және т.б.RIN: РНҚ өлшемдеріне тұтастық мәндерін тағайындауға арналған РНҚ тұтастық нөмірі.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine адамның иммундық репертуарының пайдаланушы нұсқаулығы (Баспа № MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Лиа Си Вехмас, Чарльз Е Вуд, Брайан Н Чорли, Кэрол Л Яук, Гейл М Нельсон, Сюзан Д Хестер, мұрағаттық формалинмен бекітілген парафинмен ендірілген ұлпа үлгілерінен алынған РНҚ бағалауға арналған жақсартылған сапа көрсеткіштері, токсикологиялық ғылымдар, тамыз 170, бет. 7–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/