RT-qPCR эксперименті РНҚ экстракциясы мен сапасын бағалауды, кері транскрипцияны және qPCR үш қадамын қамтиды, әр қадамда көптеген сақтық шаралары бар, біз төменде егжей-тегжейлі таныстырамыз.

Ⅰ.РНҚ сапасын бағалау

RT-qPCR экспериментінде РНҚ экстракциясы аяқталғаннан кейін РНҚ сапасын бағалау қажет, ал кейінгі эксперимент біліктіліктен өткеннен кейін ғана жүргізілуі мүмкін.Бағалау әдістеріне спектрофотометр, Agilent гель электрофорезі, Agilent 2100 талдауы жатады, олардың ішінде ең жиі қолданылатын спектрофотометр және агарозды гель электрофорезін анықтау әдісі.РНҚ сапасын қамтамасыз ету үшін РНҚ концентрациясын, тазалығы мен тұтастығын анықтау мен талдауды аяқтау үшін осы екі әдісті бірге қолдану қажет екенін атап өткен жөн.

Қатысты РНҚ оқшаулау жинағы: 

Жасушаның жалпы РНҚ оқшаулау жинағы

Жоғары тазартылған және жоғары сапалы жалпы РНҚ-ны әртүрлі өсірілген жасушалардан 11 минут ішінде алуға болады.

Жануарлардың жалпы РНҚ оқшаулау жинағы

Жануарлардың әртүрлі ұлпаларынан жоғары таза және жоғары сапалы жалпы РНҚ-ны тез және тиімді түрде алыңыз.

Спектрофотометр:

Спектрофотометр негізінен РНҚ концентрациясын және тазалығын анықтау үшін қолданылады, бірақ ол РНҚ тұтастығын және геномдық қалдықты анықтай алмайды.Олардың ішінде A260/280 және A260/230 РНҚ тазалығын анықтаудың маңызды параметрлері болып табылады, ал РНҚ тазалығын олардың мәндерінің ауытқуына сәйкес анықтауға болады:

1. 1,9< A260/280< 2,1, РНҚ тазалығы жақсы екенін көрсетеді;A260/280<1,9, РНҚ-да ақуыз қалдығы болуы мүмкін екенін көрсетеді;A260/280>2.1, РНҚ-ның мүмкін болатын ішінара ыдырауын көрсетеді, оны одан әрі агарозды гель электрофорезі арқылы растауға болады.

2. 2,0< A260/230< 2,2, РНҚ тазалығы жақсы екенін көрсетеді;A260/230< 2.0, РНҚ-да фенолдар, этанол немесе қанттар сияқты органикалық реагенттердің қалдықтары болуы мүмкін екенін көрсетеді.

Агарозды гель электрофорезі:

Агарозды гельді электрофорез талдауы РНҚ тұтастығын, геномды және ақуыз қалдықтарын талдай алады, бірақ РНҚ концентрациясын дәл анықтай алмайды немесе органикалық реагенттердің қалдықтарын анықтай алмайды.Мысалы, эукариоттық РНҚ үлгілерін алайық:

1. РНҚ агарозды гельдік электрофорезге ұшырады.Егер гельдік картада 28sRNA, 18sRNA және 5,8sRNA-ның тек үш жалғыз жолағы болса, бұл экстракцияланған РНҚ бұзылмағанын көрсетеді.Егер сүйрету құбылысы болса, бұл РНҚ-ның жартылай деградациясын көрсетеді.

2. Желім тесігі мен 28sRNA жолағы арасында жалғыз жарқын жолақ болса, геномдық ДНҚ қалдығы болуы мүмкін.

3. Егер желім тесігінде жолақтар пайда болса, бұл ақуыздың және басқа жоғары молекулалық заттардың қалдықтары болуы мүмкін екенін көрсетеді.

Ⅱ. Кері транскрипция

РНҚ экстракциясы аяқталғаннан кейін оны келесі эксперименттер үшін cDNA-ға айналдыру керек, сондықтан кері қадам жасау маңызды.Кері транскрипция кері транскриптаза мен праймерді таңдаудан енгізіледі:

Кері транскриптазаны таңдау:

Әдеттегі кері транскриптазаларға AMV RTase және MMLV RTase жатады.AMV RTase RNase H күшті белсенділікке, қысқа синтез ұзақтығына, төмен синтез көлеміне және жақсы термиялық тұрақтылыққа (42 ~ 55 ℃) ие.MMLV RTase RNase H белсенділігі әлсіз, синтез ұзақтығы ұзақ, синтез мөлшері жоғары және термиялық тұрақтылығы нашар (37 ~ 42 ℃).

RNase H ферменті РНҚ шаблонын ыдырату функциясына ие болғандықтан, кері транскрипция кезінде әлсіз RNase H белсенділігі бар MMLV таңдалуы керек, ал кейінірек гендік инженериядан кейін MMLV термиялық тұрақтылығы сапалы секіріске жетті.Foregene қабылдауБолжамды кері транскриптаза (кері транскрипция үшін M-MLV) мысал ретінде бұл генетикалық рекомбинация технологиясын пайдалана отырып, E. coli инженерлік бактерияларында көрсетілген жаңа кері транскриптаза.Бұл бір тізбекті РНҚ, ДНҚ немесе РНҚ:ДНҚ гибридінен комплементарлы ДНҚ тізбегін синтездейтін рекомбинантты ДНҚ полимераза.Оның RNase H белсенділігі жоқ, күшті тұрақтылық, күшті РНҚ жақындығы және жоғары анықтау сезімталдығы.

 

Болжамды кері транскриптаза (кері транскрипция үшін M-MLV)

Праймерді таңдау:

Әдетте RT праймерлер үш санатқа бөлінеді: олиго dT, кездейсоқ праймерлер және генге тән праймерлер.Әртүрлі эксперименттік талаптарға сәйкес пайдалану үшін қолайлы праймерлерді таңдаңыз.

1. Егер үлгі эукариоттық текті болса және кеш кДНҚ әдеттегі ПТР күшейту үшін пайдаланылса, Олиго (dT) ұсынылады;Егер келесі тәжірибе тек qPCR үшін пайдаланылса, кері транскрипцияның тиімділігін арттыру үшін Oligo (dT) кездейсоқ праймерлермен араластыру ұсынылады.

2. Үлгі прокариоттардан болса, кері транскрипция үшін кездейсоқ праймерлер немесе генге тән праймерлер таңдалуы керек.

Ⅲ.qPCR

Флуоресценцияны сандық анықтау негізінен сандық әдістерді таңдаудан, праймерді жобалау принциптерінен, ROX таңдаудан, реакция жүйесінің конфигурациясынан және реакция жағдайларын орнатудан және т.б. әзірленеді.

Сандық әдістерді таңдау:

Сандық әдістер салыстырмалы сандық әдістер және абсолютті сандық әдістер болып бөлінеді.Салыстырмалы сандық анықтауды белгілі бір емдеу әдістерінің ген экспрессиясына әсерін анықтау, әртүрлі уақытта ген экспрессиясының айырмашылығын анықтау және әртүрлі тіндердегі ген экспрессиясының айырмашылығын салыстыру үшін қолдануға болады.Абсолютті сандық анықтау вирустағы нуклеин қышқылының мөлшерін және т.б.Тәжірибе жасағанда біз өз тәжірибемізге сәйкес тиісті сандық әдістерді таңдауымыз керек.

Праймерді жобалау принциптері:

qPCR үшін праймердің дизайны күшейту тиімділігі мен өнімнің ерекшелігіне тікелей байланысты.Сондықтан жақсы праймерлерді дұрыс құрастыру сәтті qPCR-дің алғашқы қадамы болып табылады.Праймерді жобалау кезінде әдеттегі праймер дизайны принципіне сәйкес келесі принциптерге назар аудару керек:

1. Мақсатты фрагменттің ұзындығы 100 мен 300 б.б. арасында басқарылады;

2. Геномдық ДНҚ әсерін болдырмау үшін кроссэксондық дизайн;

3. Жобаланған праймерлерді күшейту тиімділігіне сынау қажет және күшейту тиімділігі стандартқа (90-110%) жеткенде ғана оларды сандық эксперименттер үшін пайдалануға болады;

4. Праймер концентрациясы әдетте 0,1uM және 1,0uM арасында оңтайландырылған.

таңдауROX:

Сандық реакция процесінде ROX оптикалық жол айырмашылығын, тамшуыр қатесін немесе булану мен конденсациядан туындаған көлем айырмашылығын біркелкі реттей алады, бұл нәтижелердің қайталануын жақсартады.Дегенмен, ROX таңдауы құралға қатысты екенін атап өткен жөн.qPCR құралында саңылаулар арасындағы айырмашылықты автоматты түрде түзету функциясы болса, оған ROX қосудың қажеті жоқ;әйтпесе, ROX түзетуін қосу керек.Реагенттерді сатып алудағы шағын серіктестер дұрыс ROX таңдау үшін қолданылатын құралға сәйкес болуы керек, кейінірек қателіктер жібермеу керек.

Реакция жүйесін дайындау:

Реакция көлемі 20ul және 50ul артықшылық береді.Жүйені құру кезінде келесі мәселелерге назар аудару керек:

1. Реакция жүйесін ультра таза жұмыс үстелінде желдету арқылы дайындау керек, жаңа ddH₂О әр тәжірибе үшін қолданылады;

2. Әрбір эксперимент жүйеде ластану бар-жоғын тексеру үшін NTC дайындауы керек және жүйені дайындаған кезде әрбір праймер жұбы NTC жасауы керек;

3. РНҚ үлгісінде гДНҚ қалдығының бар-жоғын анықтау үшін анықтау үшін әрбір үлгі үшін NRT дайындалуы мүмкін;

4. Жүйені дайындау кезінде бір үлгі үшін кемінде 3 техникалық қайталауды орындау ұсынылады;

5. Үлгі cDNA болғанда, qPCR тәжірибесінде кері транскрипция жүйесінің тежелу әсерін азайту үшін 5-10 рет сұйылту ұсынылады.Үлгі мөлшерін градиент бойынша зерттеген дұрыс, осылайша КТ мәні 20-30 аралығына түседі;

6. Реакциялардың қажетті санын анықтап, реакциялар саны негізінде 5-10%-ға арттырып, көлемдік конфигурация нөмірін есептеңіз;

7, жүйе центрифугалаудан кейін араластыру және көпіршіктердің болмауын қамтамасыз ететін премикс принципін пайдалана отырып дайындалады;

8, мүмкіндігінше қолдаушы шығын материалдарын таңдау.

Қатысты RT-qPCR жинағы