Анықтау ерекшелігі

Көп жағдайда праймер дизайнының мақсаты ПТР ерекшелігін барынша арттыру болып табылады.Бұл көптеген айнымалылардың азды-көпті болжауға болатын әсерімен анықталады.Маңызды айнымалылардың бірі - праймердің 3′ соңындағы реттілік.

Маңыздысы, ерекшелікке арналған ПТР талдаулары кең динамикалық диапазонда жоғары тиімділікті сақтайды, өйткені талдау спецификалық емес күшейту өнімдерін шығармайды, осылайша ПТР реагенттерімен бәсекелеседі немесе негізгі күшейту реакциясын тежейді.

Әрине, кейбір жағдайларда ерекшелік ең маңызды емес, мысалы, мақсат тығыз байланысты, бірақ әртүрлі патогендердің санын анықтау болса, арнайы дизайн, оңтайландыру және тексеру стандарттары қажет.

Балқу қисығы ампликондардың ерекшелігін бағалаудың стандартты әдісі болып табылады, ең болмағанда бір нысананы күшейту керек пе деген мағынада.Дегенмен, балқу қисықтары жаңылыстыруы мүмкін екенін атап өту керек, себебі, мысалы, оларға оңтайлы емес праймерлердің және шаблонның төмен концентрацияларының бірлескен әсерлері әсер етуі мүмкін.

P5 |Балқу қисығы екі мақсатты ДНҚ әртүрлі мөлшердегі екі анықтаудан алынған Tm ығысуларын көрсетеді.

A. Жоғары концентрацияларда (ad)), qPCR өлшеуі аяқталғаннан кейін айқын праймер димері болмайды.Үлгі концентрациясы 50 көшірмеге дейін азайған сайын (e), спецификалық емес өнім пайда бола бастайды және ең төменгі концентрацияда (f) жалғыз өнімге айналады.

B. Сынақ барлық мақсатты концентрацияларда бірдей Tms тіркелді және тіпті ең төменгі концентрацияда (5 көшірме) айқын праймер димері болмады.Осы екі анықтау әдісін пайдаланған кезде NTC-де күшейту өнімдері анықталмады.

P5 үлгісі әртүрлі концентрацияларда болатын үлгілермен алынған еру қисықтарын көрсетеді.P 5a ең төменгі екі концентрацияда өндірілген спецификалық емес күшейту өнімдерінің Tms нақты ампликондарға қарағанда төмен екенін көрсетеді.

Әлбетте, бұл анықтау әдісі төмен концентрацияларда бар нысаналарды анықтау үшін сенімді түрде қолданыла алмайды.

Бір қызығы, NTCs, яғни ДНҚ мүлде жоқ үлгілер (спецификалық емес) күшейту өнімдерін жазбады, бұл фондық геномдық ДНҚ спецификалық емес күшейтуге/полимерленуге қатыса алатынын көрсетеді.

Кейде мұндай фондық праймерлерді және спецификалық емес күшейтуді жою мүмкін емес, бірақ көбінесе кез келген шаблон концентрациясында және NTC (P 5b) спецификалық емес күшейтуі жоқ анықтау әдісін жобалауға болады.

Мұнда Cq 35 арқылы мақсатты концентрацияны күшейтуді тіркеудің өзі нақты еру қисығын береді.Сол сияқты, NTCs арнайы емес күшейту белгілерін көрсетпеді.Кейде анықтау әрекеті аналық сұйықтыққа байланысты болуы мүмкін және әртүрлі Mg2+ концентрацияларына қатысты болуы мүмкін белгілі бір буферлік композицияларда тек спецификалық емес күшейту анықталады.

Анықтау тұрақтылығы

Ta оңтайландыру эмпирикалық тексеру және qPCR анықтауды оңтайландыру процесіндегі пайдалы қадам болып табылады.Ол NTC күшейтпей-ақ ең төменгі Cq беретін температураны (немесе температура диапазонын) көрсету арқылы праймер жиынтығының беріктігін тікелей көрсетеді.

Сезімталдықтағы екі-төрт еселік айырмашылық мРНҚ экспрессиясы жоғары адамдар үшін маңызды болмауы мүмкін, бірақ диагностикалық сынақтар үшін бұл оң және жалған теріс нәтижелер арасындағы айырмашылықты білдіруі мүмкін.

qPCR праймерлерінің Ta қасиеттері әртүрлі болуы мүмкін.Кейбір сынақтар өте берік емес, егер олар праймерлердің оңтайлы Ta мәні бойынша орындалмаса, олар тез құлап кетеді.

Бұл өте маңызды, өйткені нақты әлемде анықтаудың бұл түрі жиі проблема туғызады және үлгінің тазалығы, ДНҚ концентрациясы немесе басқа ДНҚ-ның болуы оңтайлы болмауы мүмкін.

Бұған қоса, мақсатты көшірме саны кең ауқымда өзгеруі мүмкін және реагенттер, пластикалық ыдыстар немесе құралдар сынақты орнату кезінде пайдаланылатындардан басқаша болуы мүмкін.

P6|Температура градиенті ПТР анықтаудың әртүрлі беріктігін көрсетеді.

A. Адам миының РНҚ-сынан дайындалған cDNA бойынша ПТР орындау үшін Bioline компаниясының Sensifast SYBR мастермиксін (каталог нөмірі BIO-98050) пайдаланыңыз.

B. Апаленнің күшейту картасын және еру қисығын жазу үшін Bio-Rad CFX qPCR құралын пайдаланыңыз (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. ACSBG1 күшейту графигі және балқу қисығы (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. GFAP күшейту графигі және еру қисығы (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).

E. 7C температура градиентінде жазылған Cq ​​айырмашылығын көрсететін әртүрлі күйдіру температураларында жазылған Cqs.

P 6 қалаусыз сынақтың типтік нәтижесін көрсетеді, мұнда qPCR 59C және 67C (P 6a) арасындағы Tas градиентін пайдаланып, адам миына тән үш генге арналған праймерлерді пайдалана отырып орындалды.

Күшейту графигінен Opalin праймерлерінің идеалдан алыс екенін көруге болады, өйткені олардың оптималды Ta диапазоны өте тар (6б-сурет), яғни Cq кең таралған, нәтижесінде Cq олардың оңтайлы Cqs Low көрсеткіштерімен айтарлықтай салыстырылады.

Бұл анықтау әдісі тұрақсыз және оңтайлы емес күшейтуге әкелуі мүмкін.Сондықтан, бұл праймерлер жұбы қайта жасалуы керек.Сонымен қатар, балқу қисығын талдау (кірістіру) бұл анықтау әдісінің ерекшелігі де проблемалы болуы мүмкін екенін көрсетеді, өйткені әрбір Ta балқу қисығы әртүрлі.

P 6c-да көрсетілген ACSBG1 анықтау әдісі жоғарыдағы Opalin анықтау әдісіне қарағанда сенімдірек, бірақ ол әлі де идеалдан алыс және оны жақсартуға болады.

Дегенмен, біз беріктік пен ерекшелік арасында қажетті байланыс жоқ екенін атап өтеміз, өйткені осы анықтау әдісімен алынған еру қисығы барлық Tas (кірістіру) бойынша бірдей шың мәнін көрсетеді.

Екінші жағынан, беріктік сынағы P 6d көрсетілген GFAP сынағы сияқты Tas кең диапазонында ұқсас Cq өндіретін әлдеқайда төзімді.

Бірдей 8 градус Цельсий диапазонында алынған Cq ​​айырмашылығы 1-ден аз, ал еру қисығы (кірістіру) осы температура диапазонындағы анықтау сипаттамаларын растайды.Айта кету керек, есептелген Tas және нақты Ta диапазоны өте әртүрлі болуы мүмкін.

Зерттеушілерге тиімді праймерлерді жобалауға көмектесетін көптеген нұсқаулар бар, олардың көпшілігі бұрыннан қалыптасқан ережелерге негізделген және праймерлердің 3′соңына көп көңіл бөлінген.Жиі 3' ұшына G немесе C және екі G немесе C негізін (GC қысқышы) қосу ұсынылады, бірақ соңғы 5 негіздің екеуінен көп емес.

Іс жүзінде бұл ережелер зерттеушілерге бағыт-бағдар бере алады, бірақ олар барлық жағдайда міндетті түрде дұрыс емес.

P7 |Праймердің 3′ ұшы ерекшелікке немесе тиімділікке аз әсер етеді.

A. Адамның HIF-1α (NM_181054.2) геніне арналған праймерлердің орны.

B. Алты сынақ тапсырмасын күшейту үшін Agilent Brilliant III SYBR Green аналық ликерін (кат. № 600882) пайдаланыңыз.

C. Bio-Rad CFX qPCR құралы және 3′соңғы праймерлер арқылы жазылған күшейту графигі және балқу қисығы.NTC қызыл түспен көрсетілген.

D. Әрбір сынақ элементінің Cqs жазбасы

Мысалы, P 7 нәтижесі 3′соңғы ережесіне қайшы келеді.Барлық конструкциялар негізінен бірдей нәтиже береді, тек екі праймер комбинациясы NTC-де спецификалық емес күшейтуге әкеледі.

Дегенмен, біз GC клипінің әсерін қолдай алмаймыз, өйткені бұл жағдайда A немесе T мәнін максимум 30 негіз ретінде пайдалану ерекшелікті төмендетпейді.

F праймері GGCC-де аяқталатын C сынағы NTC-де Cq жазып алды, бұл 30-соңында бұл тізбектерден аулақ болғыңыз келетінін көрсетті.Праймер жұбының ең жақсы 3′соңғы реттілігін анықтаудың жалғыз жолы кейбір үміткер праймерлерді эксперименталды түрде бағалау екенін атап өтеміз.

Күшейтудің тиімділігі

Маңыздысы, спецификалық емес ПТР анықтау ешқашан спецификалық бола алмаса да, күшейту тиімділігін ферментті, аналық сұйықтықты, қоспаларды және цикл жағдайларын өзгерту арқылы әр түрлі жолдармен реттеуге және барынша арттыруға болады.

ПТР анықтау тиімділігін бағалау үшін мақсатты нуклеин қышқылынан 10 немесе 5 есе көп сериялы сұйылтуды, яғни «стандартты қисық әдісті» қолданған дұрыс.

Егер стандартты қисық генерациялау үшін ПТР ампликондары немесе синтетикалық ДНҚ нысандары пайдаланылса, осы нысандардың сериялық сұйылтулары фондық ДНҚ-ның тұрақты мөлшерімен (мысалы, геномдық ДНҚ) араластырылуы керек.

P8 |ПТР тиімділігін бағалау үшін сұйылту қисығы.

A. ПТР және балқу қисығы жағдайлары үшін HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA және R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC және Agilent's Brilliant III SYBR Green мастермиксі (каталог нөмірі 600882) үшін праймерлерді пайдаланыңыз.

B. 100 нг РНҚ кері транскрипцияланды, 2 рет сұйылтылған және сериялық сұйылтылған cDNA үлгілері 1 нг адам геномдық ДНҚ-ға дейін 5 рет сұйылтылған.Балқу қисығы кірістірмеде көрсетілген.

C. RT реакциясы, сұйылту және сериялық сұйылту екінші cDNA үлгісі үшін қайталанды және нәтижелер ұқсас болды.

P 8 екі түрлі cDNA үлгілерінде бірдей анықтау әдісін қолданатын екі стандартты қисықты көрсетеді, нәтиже бірдей тиімділік, шамамен 100% және R2 мәні де ұқсас, яғни эксперименттік деректер мен регрессия сызығы немесе деректер арасындағы сәйкестік дәрежесі Сызықтылық дәрежесі.

Екі стандартты қисық салыстыруға болады, бірақ дәл бірдей емес.Егер мақсат мақсатты нақты сандық анықтау болса, белгісіздікті түсіндірместен көшірме нөмірін есептеуге жол берілмейтінін ескеру қажет.

P9 |Стандартты қисық арқылы сандық анықтаумен байланысты өлшеу белгісіздігі.

A. ПТР және балқу қисығы шарттарын орындау үшін GAPDH (NM_002046) үшін праймерлерді пайдаланыңыз.F: ACAGTTGCCATGTAGACC және R: TAACTGGTTGAGCACAGG және Bioline компаниясының Sensifast SYBR мастермиксі (каталог нөмірі BIO-98050).

B. Bio-Rad CFX qPCR құралымен жазылған күшейту диаграммасы, балқу қисығы және стандартты қисық.

C. Стандартты қисық графигі және 95% сенімділік интервалы (CI).

D. Сұйылту қисығынан алынған үш Cq мәнінің көшірме нөмірі және 95% сенімділік аралығы.

P 9 оңтайландырылған сынақ үшін бір стандартты қисықтың тән өзгермелілігі шамамен 2 есе (95% сенімділік аралығы, минимумнан максимумға дейін) болатынын көрсетеді, бұл күтуге болатын ең аз өзгергіштік болуы мүмкін.

Қатысты өнім:

Cell Direct RT qPCR жинағы

Mouse Tail Direct ПТР жинағы

Animal Tissue Direct ПТР жинағы