Барлығы qRT-PCR экспериментінің принципі, праймерді жобалау, нәтижелерді интерпретациялау және т.б. туралы айтады, бірақ мен сіздермен qRT-PCR эксперименттік жұмысымен бөлісуім керек деп ойлаймын.Бұл кішкентай, бірақ нәтиже туралы.
qRT-ПТР жасамас бұрын, біз өзіміздің РНҚ және жұмыс әдістерін нақты түсінуіміз керек.Өйткені, біздің күш-жігеріміз жай ғана жаттығуға емес, нәтижеге жетуге бағытталған.Сондықтан qRT-ПТР жасамас бұрын, біз келесі мәселелерді анықтауымыз керек (олардың кейбіреулері тек SYBR үшін жарамды).
1 РНҚ бұзылмағанына сенімдісіз бе?
NanoDrop 2000 тек РНҚ концентрациясы мен тазалығын анықтай алады, бірақ РНҚ тұтастығын анықтай алмайды.
RNA (RNA Intesity Number) мәні Agilent 2100 Bioanalyzer жүйесі арқылы анықталатын РНҚ тұтастығын көрсете алады.
Сурет. Әртүрлі РНҚ үлгілері (эукариоттар) үшін RIN мәндерінің схемалық диаграммасы
Дегенмен, зертханаларда әдетте Agilent 2100 биоанализері жоқ.Бұл жағдайда формальдегидті гель арқылы анықтай аламыз, бірақ РНҚ-ның жалпы мөлшеріне қойылатын талап жоғары, сондықтан ең жылдам әдіс қарапайым гельдік электрофорезді қолдану болып табылады.Ол нуклеазасыз ортада болу керек, сондықтан электрофорезге арналған резервуарды, зол бөтелкесін, гель кронштейнін және DEPC суымен тарақты шаю қажет.Агароза сонымен қатар нуклеазасыз (ол жаңадан ашылғанша) және Жүктеу буферін 1,2% гельмен мүмкіндігінше жаңадан ашу керек.
Гельді толығымен еріту керек екенін ескеріңіз, әйтпесе ол суреттегі 9 үлгіде көрсетілгендей біртекті емес жолақтарды тудырады.Кернеу тым жоғары болса немесе тым ұзақ жұмыс істеп тұрса, жылуды тудырады және РНҚ деградациясын тудырады, сондықтан кернеу мен уақытты ақылға қонымды бақылау керек.Сонымен қатар, гельді іске қосу үлгіде ДНҚ қалдығының бар-жоғын әрі қарай анықтауға және тарату ұңғымасында сақталған жолақтардың көп санының бар-жоғын бақылай алады.
Сурет.РНҚ гельдік электрофорезді анықтау
2 Сіз cDNA концентрациясына сенімдісіз бе?
Лабораториядағы үлкен ағалардың тәжірибесі әрбір инверсия арқылы алынған 20 ul жүйесінің cDNA-сы 20X тікелей сұйылтылған, ал пост-докторлық апалар 10X сұйылтылған.Мен әдетте жағдайға байланыстымын.Әр адам айтқан РНҚ-ның сапасы әртүрлі болғандықтан, реверсивтілік деңгейі де әртүрлі, ал кері айналдыру технологиясы тұрақты болмауы мүмкін.
Сондықтан мен кері cDNA алған сайын, мен оны алдымен шамамен 3 есе сұйылтамын, содан кейін RT-PCR жасау үшін үй шаруашылығы генін қолданамын, циклдар саны әдетте 25 циклды құрайды, нақты концентрацияны анықтау үшін, содан кейін соңғы сұйылту коэффициентін анықтайды.
3 Праймерлерді пайдалану оңай екеніне сенімдісіз бе?
Ол qRT-PCR балқу қисығынан өте алады, бірақ бұл әлі де ақшаны талап етеді.Көп ақшасы жоқ зертханалар үшін, олар көп праймер алған кезде, олар қарапайым RT-ПТР көмегімен оның бір жолақ екенін және праймерлердің ерекшелігін анықтай алады.Зертханада ақша тапшы болмаса, барлық праймерлердің ерекшелігін балқу қисығы арқылы бір рет анықтауға болады.
4 Эксперименттік жағдайларыңыз қолайлы екеніне сенімдісіз бе?
SYBR күшті жарықтан қорғалған болуы керек, сондықтан SYBR реагентін қосқанда үстіңгі жарығын өшіріп көріңіз және оны аяқтау үшін күңгірт жарықты ғана пайдалану керек.
SYBR 4°C температурада сақтаңыз.Қолдану кезінде көбік пайда болмас үшін жақсылап араластыру үшін жоғары және төмен төңкеріңіз және қатты құймаңыз.
Кейбір жас әпкелер үлгілерді араластырудан қорқып, ПТР тақтасына белгілер салғанды ұнатады, бұл дұрыс емес.Сіздің маркерлеріңіз флуоресцентті сигналдардың жиналуына әсер етуі мүмкін болғандықтан, мен әдетте жасөспірімдерге төменде көрсетілгендей жадыға көмектесу үшін тәжірибелік жазу кітапшаларын пайдалануды ұсынамын.
Сурет.qRT-ПТР үлгісін жүктеу диаграммасы
5 Сіз мұны дұрыс істеп жатқаныңызға сенімдісіз бе?
Міндетті түрде қолғап киіңіз, қолғап киіңіз, қолғап киіңіз және маңызды нәрселерді үш рет айтыңыз.
SYBR жарық әсерін азайту үшін мен төмендегі суретте көрсетілгендей алдымен үлгіні қосқанды ұнатамын.Тәжірибеге сәйкес, үлгінің аз мөлшерін қосу іріктеу қателерін тудыруы мүмкін.Сондықтан үлгінің аз мөлшерін қосудан туындаған қатені азайту үшін әдетте үлгіні қайтадан екі еселендіремін және қосылған H2O2 мөлшерін азайту үшін үлгіні қосқанда екі есе көбейтемін.
Сурет.qRT-ПТР жүктеудің схемалық диаграммасы
Содан кейін qRT-PCR жүйесін келесідей конфигурациялаңыз.
Сурет.qRT-ПТР жүйесін дайындау диаграммасы
ЕСКЕРТПЕ: Конфигурациялау процесі мұзда орындалуы керек.
Үлгіні қосқаннан кейін мөлдір тығыздағыш пленканы қойыңыз.Қолыңызбен мөлдір тығыздағыш пленка бетіне тимеуге тырысыңыз, тек пленканың екі жағындағы кеңістіктен әрекет етіңіз.Өйткені саусақ іздері флуоресцентті сигналдардың жиналуына да әсер етуі мүмкін.Содан кейін үлгі қабырғаға ілініп қалмас үшін төмен жылдамдықпен 10 секунд жылдам центрифугалау үшін центрифуганы пайдаланыңыз.
Қосымша тауарлар:
Жіберу уақыты: 28 сәуір-2023 ж
