Праймер дизайнының негізі (99% мәселелерді шешуге болады)
1. Праймер ұзақтығы: Оқулық 15-30б.п., әдетте шамамен 20б.б.Нақты жағдай ерекшелігін қамтамасыз ету үшін 18-24bp болуы жақсы, бірақ ұзағырақ жақсы, тым ұзақ праймер, сондай-ақ ерекшелігін азайтады, және кірістілігін төмендетеді.
2. Праймерді күшейту аралығы: 200-500bp сәйкес келеді және фрагментті нақты жағдайларда 10кб дейін кеңейтуге болады.
3. Праймер негізі: G+C мазмұны 40-60% болуы керек, тым аз G+C күшейту әсері жақсы емес, тым көп G+C арнайы емес жолақтар пайда болуы оңай.ATGC 5-тен астам пурин немесе пиримидин нуклеотидтерінің кластерлерін болдырмай, кездейсоқ түрде таратылады.Тұрақтылықты арттыру үшін 5′ соңы және аралық тізбектер үшін мульти-gc, 3′ соңында бай GC-ті болдырмаңыз, соңғы 3 негіз үшін GC жоқ немесе соңғы 5 негіздің 3-і үшін GC жоқ.
4. Праймерлерде қосалқы құрылымды болдырмаңыз және екі праймер арасындағы комплементацияны болдырмаңыз, әсіресе 3 'ұшындағы комплементация, әйтпесе праймер димері қалыптасады және спецификалық емес күшейтілген жолақтар пайда болады.
5. Праймерлердің 3 'ұшындағы негіздерді, әсіресе соңғы және соңғыдан кейінгі негіздерді жұпталмаған терминал негіздеріне байланысты ПТР сәтсіздігін болдырмау үшін қатаң түрде жұптастыру керек.
6. Праймерлердің тиісті бөліну учаскелері бар немесе қосылуы мүмкін, ал күшейтілген мақсатты реттілікте бөлуді талдау немесе молекулалық клондау үшін өте тиімді болатын тиісті бөліну орындары болуы керек.
7. Праймерлердің ерекшелігі: праймерлердің нуклеин қышқылы тізбегі дерекқорындағы басқа тізбектермен айқын гомологиясы болмауы керек.
8. Бағдарламалық құралды пайдалануды үйреніңіз: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Бұл онлайн дизайн жақсы жұмыс істейді).
Жоғарыда көрсетілген мазмұн праймер дизайны мәселелерінің кем дегенде 99% шеше алады.
Праймер дизайнының бөлшектерін бақылау
1. Праймер ұзындығы
Праймердің жалпы ұзындығы 18~30 негізді құрайды.Жалпы, праймердің жасыту температурасын анықтайтын ең маңызды фактор праймердің ұзындығы болып табылады.Праймердің жасыту температурасы әдетте таңдалады (Tm мәні -5℃), ал кейбіреулері тікелей Tm мәнін пайдаланады.Праймерлердің жасыту температурасын шамамен есептеу үшін келесі формулаларды қолдануға болады.
Праймердің ұзындығы 20 бит-тен аз болғанда: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Праймердің ұзындығы 20 бит-тен жоғары болғанда: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/ұзындығы-5℃
Сонымен қатар, жасыту температурасын есептеу үшін көптеген бағдарламалық қамтамасыз етуді де қолдануға болады, есептеу принципі басқаша болады, сондықтан кейде есептелген мәнде шағын бос орын болуы мүмкін.ПТР реакцияларын оңтайландыру үшін ең жақсы тиімділік пен ерекшелік үшін 54℃ төмен емес жасыту температурасын қамтамасыз ететін ең қысқа праймерлер қолданылады.
Тұтастай алғанда, праймердің ерекшелігі әрбір қосымша нуклеотид үшін төрт есе артады, сондықтан көптеген қолданбалар үшін ең аз праймер ұзындығы 18 нуклеотидті құрайды.Праймер ұзындығының жоғарғы шегі өте маңызды емес, негізінен реакция тиімділігіне байланысты.Энтропияға байланысты праймер неғұрлым ұзағырақ болса, ДНҚ-полимеразаның байланысуы үшін тұрақты қос тізбекті шаблонды қалыптастыру үшін мақсатты ДНҚ-мен байланысу жылдамдығы соғұрлым төмен болады.
Праймерлерді жобалау үшін бағдарламалық құралды пайдаланған кезде, праймерлердің ұзындығын өз кезегінде TM мәнімен анықтауға болады, әсіресе флуоресценциялық сандық ПТР праймерлері үшін, TM=60℃ немесе т.б. бақылау керек.
2.GC мазмұны
Әдетте, праймер тізбегіндегі G+C мазмұны 40% ~ 60% құрайды және праймерлер жұбының GC мазмұны мен Tm мәні үйлестірілуі керек.Егер праймерде елеулі GC немесе AT тенденциясы болса, праймердің 5 'ұшына сәйкес A, T немесе G және C құйрығын қосуға болады.
3. Күйдіру температурасы
Жасыту температурасы шынжырдан босату температурасынан 5℃ төмен болуы керек.Егер праймер негіздерінің саны аз болса, жасыту температурасын тиісті түрде арттыруға болады, бұл ПТР ерекшелігін арттыруы мүмкін.Негіздердің саны көп болса, жасыту температурасын тиісті түрде азайтуға болады.4℃ ~ 6℃ жұбының жасыту температурасының айырмашылығы ПТР өнімділігіне әсер етпейді, бірақ ең дұрысы праймер жұбының жасыту температурасы бірдей, ол 55℃ ~ 75℃ аралығында өзгеруі мүмкін.
4. Күшейту үлгісінің қайталама құрылым аймағынан аулақ болыңыз
Күшейтілген фрагментті таңдаған кезде үлгінің қайталама құрылым аймағынан аулақ болған дұрыс.Мақсатты фрагменттің тұрақты қайталама құрылымын үлгіні таңдауға көмектесетін тиісті компьютерлік бағдарламалық құрал арқылы болжауға және бағалауға болады.Эксперименттік нәтижелер кеңейтілетін аймақтың бос энергиясы (△G) 58,6кДж/мольден аз болған кезде кеңейту жиі сәтсіз болатынын көрсетеді.
5. Мақсатты ДНҚ-мен сәйкессіздік
Күшейтілген мақсатты ДНҚ тізбегі үлкен болғанда, праймер мақсатты ДНҚ-ның бірнеше бөліктерімен байланысуы мүмкін, нәтижесінде нәтижеде бірнеше жолақтар пайда болады.Бұл жолы BLAST бағдарламалық жасақтамасын тестілеуді пайдалану қажет, веб-сайт:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Екі ретті туралау (bl2seq) таңдаңыз.
Праймер тізбектерін 1 аймаққа және мақсатты ДНҚ тізбегін 2 аймаққа қою өзара ауыстырылады және BLAST қосымша, антисенс және басқа мүмкіндіктерді есептейді, сондықтан пайдаланушылар екі тізбектің де сезім тізбегі екенін байқамауы керек.Сондай-ақ, GI нөмірін енгізуге болады, егер сіз дерекқордағы реттіліктің GI нөмірін білсеңіз, реттіліктің үлкен бөлігін қоюдың қажеті жоқ.Соңында, праймердің мақсатты ДНҚ-да бірнеше гомологтық учаскелері бар-жоғын көру үшін 3-те туралау түймесін басыңыз.
6. Праймер терминалы
Праймердің 3 'соңы кеңейтім басталатын жер болып табылады, сондықтан сәйкессіздіктердің сол жерден басталуын болдырмау маңызды.3 'соңы 3 қатарынан G немесе C болмауы керек, себебі бұл G+C байыту реттілігі аймағында праймердің қате іске қосылуына әкеледі.Арнайы ПТР (AS-PCR) реакцияларынан басқа 3 'ұшы кез келген екінші реттік құрылым құра алмайды, праймердің 3' ұшы сәйкес келмеуі мүмкін.Мысалы, егер кодтау аймағы күшейтілсе, праймердің 3 'соңы кодонның үшінші позициясында аяқталмауы керек, өйткені кодонның үшінші позициясы деградацияға бейім, бұл күшейтудің ерекшелігі мен тиімділігіне әсер етеді.Қосымша праймерлерді пайдаланған кезде кодонды пайдалану кестесін қараңыз, биологиялық артықшылықтарға назар аударыңыз, 3′ ұшында аннексия праймерлерін қолданбаңыз және праймерлердің жоғары концентрациясын (1uM-3uM) пайдаланыңыз.
7. Праймерлердің екіншілік құрылымы
Праймерлердің өздері қосымша реттіліктерге ие болмауы керек, әйтпесе праймерлердің өздері шаш қыстырғыш құрылымдарына бүктеледі және бұл екінші реттік құрылым стерикалық кедергіге байланысты праймерлер мен шаблондарды байланыстыруға әсер етеді.Егер жасанды пайымдаулар қолданылса, праймерлердің үздіксіз толықтырушы негіздерінің өзі 3б.б артық болмауы керек.Екі праймер арасында комплементарлылық болмауы керек, әсіресе праймер димерлерінің пайда болуын болдырмау үшін 3 'ұшының қосымша қабаттасуына жол бермеу керек.Жалпы алғанда, бір жұп праймерлер арасында 4 дәйекті негіз гомологиясы немесе комплементарлылығы болмауы керек.
8. Маркерлерді немесе локустарды қосыңыз
5 'соңы күшейту ерекшелігіне аз әсер етеді және сондықтан күшейту ерекшелігіне әсер етпестен өзгертуге болады.5-праймердің модификациясы мыналарды қамтиды: ферментті шектеу аймағын қосу;Белгіленген биотин, флуоресценция, дигоксин, Eu3+ және т.б. Ақуызды байланыстыратын ДНҚ тізбегін енгізу;Мутация учаскелерін енгізу, мутация тізбегін енгізу және жоғалту және промоторлар ретін енгізу және т.б.. Қосымша негіздер күшейтудің тиімділігіне азды-көпті әсер етеді және праймер димерінің пайда болу мүмкіндігін арттырады, бірақ келесі қадам үшін кейбір жеңілдіктер жасалуы керек.Шектеу орындары және промоторлар реттілігі сияқты мақсатты реттілікте жоқ қосымша реттіліктерді праймердің 5′ ұшына ерекшелікке әсер етпестен қосуға болады.Бұл реттіліктер бастапқы Tm мәндерін есептеуге қосылмайды, бірақ толықтыру және ішкі қайталама құрылымды тексеру керек.
9. Ішкі клондар
Көп жағдайда ПТР тек алдын ала клондау болып табылады, содан кейін біз мақсатты фрагментті әртүрлі векторларға субклондауымыз керек, сондықтан ПТР қадамында келесі операция үшін қосымша негіздерді жобалау керек.
Субклондау үшін әзірленген кейбір реттіліктер төменде жинақталған.
Рестрикциялық эндонуклеазаны шектеу аймағы қосылды
Ферменттерді шектеу орындарын қосу ПТР өнімдерін субклондау үшін ең жиі қолданылатын әдіс болып табылады.Жалпы алғанда, бөлу учаскесі алты негіз болып табылады, 5 'соңына қосымша 2 ~ 3 қорғаныс негіздерін қосу керек.Дегенмен, әртүрлі ферменттер қажет ететін қорғаныс негіздерінің саны әртүрлі.Мысалы, SalⅠ қорғаныс негізін қажет етпейді, EcoRⅤ 1 қорғаныс негізін, NotⅠ үшін 2 қорғаныс негізін және Hind Ⅲ үшін 3 қорғаныс негізін қажет етеді.
LIC құйрықты қосады
LIC толық атауы - Ligation-Independent клондау, pET векторының бір бөлігі үшін арнайы Навоген ойлап тапқан клондау әдісі.LIC әдісімен дайындалған pET тасымалдаушысының қосымша емес 12-15 негізді бір жіпті жабысқақ ұштары бар, олар мақсатты кірістіру фрагментіндегі сәйкес жабысқақ ұштарды толықтырады.Күшейту мақсатында енгізілген фрагменттің праймер 5′ тізбегі LIC векторын толықтыруы керек.T4 ДНҚ полимеразасының 3′→5′ экстранективті белсенділігі қысқа уақыттан кейін енгізілген фрагментте бір тізбекті жабысқақ ұшын құра алады.Өнім тек дайындалған кірістіру фрагменті мен вектордың өзара жасытуынан түзілуі мүмкін болғандықтан, бұл әдіс өте жылдам және тиімді және ол бағытталған клондау болып табылады.
Бағытталған ТА клоны құйрықты қосу
ТА клондау фрагментті векторға бағыттай алмады, сондықтан кейінірек Invitrogen клондауға бағытталған векторды енгізді, оның бір ұшында төрт негізгі GTGGS бар.Сондықтан, ПТР праймерлерін жобалау кезінде фрагменттерді «бағдарлауға» болатындай сәйкесінше қосымша реттіліктерді қосу керек.
Егер сізде уақыт аз болса, генді вектормен біріктіріп, тікелей синтездеуге болады, мұны біз музекуляристерде ET генінің синтезі деп атаймыз.
D. In-Fusion клондау әдісі
Лигаза қажет емес, ұзақ реакция қажет емес.Сызықтық вектордың екі шетіндегі реттілік праймерлерді жобалау кезінде енгізілген кезде, ПТР өнімі және сызықтық вектор құрамында BSA бар инфузиялық фермент ерітіндісіне қосылады және бөлме температурасында жарты сағатқа орналастырылады, трансформацияны орындауға болады.Бұл әдіс әсіресе үлкен көлемді түрлендіру үшін қолайлы.
10. Праймерді біріктіру
Кейде праймер дизайны туралы шектеулі реттілік туралы ақпарат ғана белгілі.Мысалы, егер тек аминқышқылдарының реті белгілі болса, біріктіру праймерін жобалауға болады.Біріктіру праймері - бір амин қышқылын кодтайтын барлық әртүрлі негіз мүмкіндіктерін білдіретін әртүрлі тізбектердің қоспасы.Ерекшелікті арттыру үшін әртүрлі организмдердің негізгі пайдалану қалауларына сәйкес аннексияны азайту үшін кодонды пайдалану кестесіне жүгінуге болады.Праймердің жасыту температурасын төмендету үшін гипоксантинді барлық негіздермен жұптастыруға болады.Праймердің 3′ ұшында бекітілген негіздерді пайдаланбаңыз, себебі соңғы 3 негіздің 3′ ұшында жасыту дұрыс емес жерде ПТР бастау үшін жеткілікті.Көптеген қосымша қоспалардағы праймерлер мақсатты үлгіге тән емес болғандықтан, жоғары праймер концентрациялары (1μM - 3μM) пайдаланылады.
ПТР шикізатыбақылау
1. Праймер мөлшері
Әрбір праймердің концентрациясы 0,1 ~ 1умоль немесе 10 ~ 100пмоль.Праймердің ең аз мөлшерімен қажетті нәтижені шығарған дұрыс.Праймердің жоғары концентрациясы сәйкессіздікті және спецификалық емес күшейтуді тудырады және праймерлердің арасында димерлердің пайда болу мүмкіндігін арттырады.
2. Праймер концентрациясы
Праймерлердің концентрациясы ерекшелікке әсер етеді.Праймердің оңтайлы концентрациясы әдетте 0,1 мен 0,5 мкм арасында.Жоғары праймер концентрациясы спецификалық емес өнімдердің күшейтілуіне әкеледі.
3. Праймердің күйдіру температурасы
Праймерлер үшін тағы бір маңызды параметр - балқу температурасы (Тм).Бұл праймерлер мен комплементарлы тізбектердің 50% қос тізбекті ДНҚ молекулалары ретінде ұсынылған температура.ПТР жасыту температурасын орнату үшін Tm қажет.Ең дұрысы, жасыту температурасы праймерлердің мақсатты реттілікпен тиімді жасытуын қамтамасыз ету үшін жеткілікті төмен, бірақ спецификалық емес байланыстыруды азайту үшін жеткілікті жоғары.Ақылға қонымды қыздыру температурасы 55 ℃-ден 70 ℃ дейін.Күйдіру температурасы әдетте праймердің Tm деңгейінен 5℃ төмен орнатылады.
Tm орнатудың бірнеше формулалары бар, олар қолданылатын формулаға және праймерлердің реттілігіне байланысты айтарлықтай өзгереді.Көптеген формулалар есептелген Tm мәнін беретіндіктен, барлық күйдіру температуралары тек бастапқы нүкте болып табылады.Ерекшелікті жасыту температурасын біртіндеп арттыратын бірнеше реакцияларды талдау арқылы жақсартуға болады.Есептелген Tm-5℃ төменнен бастаңыз және жасыту температурасын 2℃ қадаммен біртіндеп арттырыңыз.Жоғары күйдіру температурасы праймер димерлерінің және спецификалық емес өнімдердің түзілуін азайтады.Жақсы нәтиже алу үшін екі праймердің шамамен Tm мәндері болуы керек.Егер праймер жұптарының Tm айырмашылығы 5℃-ден асса, циклде төменгі жасыту температурасын пайдалану арқылы праймерлер айтарлықтай жалған бастауды көрсетеді.Екі праймер Tm әртүрлі болса, жасыту температурасын ең төменгі Tm мәнінен 5℃ төмен етіп орнатыңыз.Немесе, ерекшелікті арттыру үшін алдымен жоғары Tm үшін есептелген жасыту температураларында бес циклды орындауға болады, содан кейін қалған циклдарды төменгі Tm үшін әзірленген жасыту температураларында орындауға болады.Бұл қатаң жағдайларда тағайындалған үлгінің ішінара көшірмесін алуға мүмкіндік береді.
4. Праймердің тазалығы мен тұрақтылығы
Пайдаланушы праймерлерінің стандартты тазалығы ПТР қолданбаларының көпшілігіне сәйкес келеді.Тұзсыздандыру арқылы бензоил және изобутилил топтарын жою өте аз, сондықтан ПТР-ға кедергі келтірмейді.Кейбір қолданбалар синтез процесінде кез келген толық емес тізбектерді жою үшін тазалауды қажет етеді.Бұл қысқартылған тізбектер ДНҚ синтезінің химиясының тиімділігі 100% болмағандықтан пайда болады.Бұл қайталанатын химиялық реакцияларды қолданатын айналмалы процесс, өйткені әрбір негіз 3′-тен 5′-ге дейін ДНҚ жасау үшін қосылады.Кез келген циклде сәтсіздікке ұшырауыңыз мүмкін.Ұзынырақ праймерлерде, әсіресе 50 негізден көп, кесілген тізбектердің үлкен үлесі бар және тазалауды қажет етуі мүмкін.
Праймерлердің шығымдылығына синтетикалық химияның тиімділігі және тазарту әдісі әсер етеді.Цитология және Шэнгонг сияқты биофармацевтикалық компаниялар барлығы олигонуклеозидтердің жалпы шығуын қамтамасыз ету үшін ең аз OD бірлігін пайдаланады.Арнайы праймерлер құрғақ ұнтақ түрінде жеткізіледі.Соңғы концентрациясы 100 мкм болатындай ТЭ-де праймерлерді қайта еріткен дұрыс.ТЭ деиондандырылған суға қарағанда жақсы, өйткені судың рН жиі қышқыл болады және олигонуклеозидтердің гидролизін тудырады.
Праймерлердің тұрақтылығы сақтау шарттарына байланысты.Құрғақ ұнтақ пен ерітілген праймерлерді -20℃ температурада сақтау керек.TE-де 10 мкм-ден жоғары концентрацияларда ерітілген праймерлерді -20℃ температурада 6 ай тұрақты сақтауға болады, бірақ тек бөлме температурасында (15℃-ден 30℃) 1 аптадан аз уақытқа сақтауға болады.Құрғақ ұнтақ праймерлерді -20 С температурада кемінде 1 жыл және бөлме температурасында (15 С - 30 С) 2 айға дейін сақтауға болады.
5. Ферменттер және олардың концентрациясы
Қазіргі уақытта қолданылатын Taq ДНҚ полимеразасы негізінен колиформды бактериялармен синтезделген гендік инженерия ферменті болып табылады.Әдеттегі ПТР реакциясын катализдеу үшін қажетті фермент мөлшері шамамен 2,5U (100ул реакцияның жалпы көлемін білдіреді).Егер концентрация тым жоғары болса, бұл спецификалық емес күшейтуге әкелуі мүмкін;егер концентрация тым төмен болса, синтетикалық өнімнің мөлшері азаяды.
6. dNTP сапасы мен концентрациясы
dNTP сапасы концентрацияға және ПТР күшейту тиімділігіне тығыз байланысты.dNTP ұнтағы түйіршікті болып табылады және дұрыс сақталмаған жағдайда оның өзгергіштігі биологиялық белсенділігін жоғалтады.dNTP ерітіндісі қышқыл болып табылады және оның PH мәнін 7,0 ~ 7,5-ке реттеу үшін 1M NaOH немесе 1M Tris.HCL буферлік ерітіндісімен жоғары концентрацияда қолданылуы керек, қосалқы қаптаманың аз мөлшері, -20℃ температурада мұздатылған сақтау.Бірнеше рет мұздату-еріту dNTP-ны нашарлатады.ПТР реакциясында dNTP 50 ~ 200умоль/л болуы керек.Әсіресе, төрт DNTPS концентрациясына назар аудару керек (тең мольдік препарат).Егер олардың кез келгенінің концентрациясы басқаларынан өзгеше болса (жоғары немесе төмен), сәйкессіздік пайда болады.Тым төмен концентрация ПТР өнімдерінің шығуын азайтады.dNTP Mg2+-мен қосылып, бос Mg2+ концентрациясын төмендете алады.
7. Үлгі (нысаналы ген) нуклеин қышқылы
Үлгі нуклеин қышқылының мөлшері мен тазарту дәрежесі ПТР сәтті немесе сәтсіздігінің негізгі буындарының бірі болып табылады.Дәстүрлі ДНҚ тазарту әдістері әдетте үлгілерді қорыту және жою үшін SDS және протеаза K пайдаланады.SDS негізгі функциялары: жасуша мембранасындағы липидтер мен ақуыздарды ерітеді, осылайша мембраналық ақуыздарды еріту арқылы жасуша мембранасын бұзады және жасушадағы ядролық ақуыздарды диссоциациялайды, SDS ақуыздармен де қосылып, тұнба түзе алады;Протеаза К белоктарды, әсіресе ДНҚ-мен байланысқан гистондарды гидролиздеп, қорыта алады, содан кейін белоктарды және басқа жасуша компоненттерін алу үшін органикалық еріткіш фенол мен хлороформды қолдана алады, ал нуклеин қышқылын тұндыру үшін этанол немесе изопропил спиртін пайдаланады.Алынған нуклеин қышқылын ПТР реакциялары үшін үлгі ретінде пайдалануға болады.Жалпы клиникалық анықтау үлгілері үшін жасушаларды еріту, қоздырғыштарды лизаттау, хромосомалардан белоктарды қорыту және бос мақсатты гендерге шығару үшін жылдам және қарапайым әдісті қолдануға болады және ПТР күшейту үшін тікелей қолданылады.РНҚ шаблонын экстракциялау әдетте РНҚ ыдыратуын болдырмау үшін гуанидин-изотиоцианат немесе протеаза К әдісін пайдаланады.
8.Mg2+ концентрациясы
Mg2+ ПТР күшейту ерекшелігі мен шығымдылығына айтарлықтай әсер етеді.Жалпы ПТР реакциясында әртүрлі dNTP концентрациясы 200умоль/л болғанда, Mg2+ тиісті концентрациясы 1,5 ~ 2,0 ммоль/л болады.Mg2+ концентрациясы тым жоғары, реакция спецификасы төмендейді, спецификалық емес күшейту орын алады, тым төмен концентрация Taq ДНҚ полимеразасының белсенділігін төмендетеді, нәтижесінде реакция өнімдері азаяды.
Магний иондары ПТР-ның бірнеше аспектілеріне әсер етеді, мысалы, кірістілікке әсер ететін ДНҚ-полимераза белсенділігі;Тағы бір мысал - ерекшелікке әсер ететін праймерді күйдіру.dNTP және шаблон магний ионымен байланысып, фермент белсенділігіне қажетті бос магний ионының мөлшерін азайтады.Магний ионының оңтайлы концентрациясы әртүрлі праймер жұптары мен үлгілері үшін өзгереді, бірақ 200μM dNTP бар типтік ПТР бастапқы концентрациясы 1,5 мм (ескертпе: нақты уақыттағы сандық ПТР үшін флуоресцентті зондпен 3-5 мм магний ионының ерітіндісін пайдаланыңыз).Бос магний иондарының жоғары концентрациясы өнімділікті арттырады, сонымен қатар спецификалық емес күшейтуді арттырады және сенімділікті төмендетеді.Оңтайлы концентрацияны анықтау үшін магний ионын титрлеу 0,5мМ 1мМ-ден 3мМ-ге дейінгі қадамдармен орындалды.Магний ионын оңтайландыруға тәуелділікті азайту үшін Platinum Taq ДНҚ полимеразасын қолдануға болады.Platinum Taq ДНҚ полимеразасы Taq DNA полимеразасына қарағанда магний иондары концентрацияларының кең диапазонында функцияны сақтай алады, сондықтан азырақ оңтайландыруды қажет етеді.
9. Pcr-ды көтермелейтін қоспалар
Жасыту температурасын, праймер дизайнын және магний ионының концентрациясын оңтайландыру көптеген үлгілерді жоғары нақты күшейту үшін жеткілікті;дегенмен кейбір үлгілер, соның ішінде жоғары GC мазмұны бар үлгілер қосымша шараларды қажет етеді.ДНҚ-ның балқу температурасына әсер ететін қоспалар өнімнің ерекшелігі мен шығымдылығын жақсартудың тағы бір әдісін ұсынады.Жақсы нәтиже алу үшін үлгіні толық денатурациялау қажет.
Сонымен қатар, қайталама құрылым праймерді байланыстыруға және ферменттің кеңеюіне жол бермейді.
ПТР қоспалары, соның ішінде формамид, DMSO, глицерин, бетаин және PCRx Enhancer Solution, күшейтуді жақсартады.Олардың ықтимал механизмі балқу температурасын төмендету болып табылады, осылайша праймерлерді жасытуға көмектеседі және қайталама құрылым аймағы арқылы ДНҚ-полимеразаның кеңеюіне көмектеседі.PCRx Solution басқа да артықшылықтарға ие.Platinum Taq ДНҚ полимеразасымен және Platinum Pfx ДНҚ полимеразасымен пайдаланылған кезде магний ионының минималды оңтайландыруы қажет.Осылайша, Platinum техникасы үшінші тәсілдің, магний ионын оңтайландырудың тәуелділігін төмендете отырып, ерекшелікті арттыру үшін қоспамен біріктірілген.Жақсы нәтиже алу үшін қоспалардың концентрациясын оңтайландыру керек, әсіресе Taq ДНҚ полимеразасын тежейтін DMSO, формамид және глицерин.
10. Ыстық бастау
Ыстық старт ПТР - жақсы праймер дизайнына қосымша ПТР ерекшелігін жақсартудың маңызды әдістерінің бірі.Taq ДНҚ полимеразасының оңтайлы ұзару температурасы 72℃ болса да, полимераза бөлме температурасында белсенді болып қалады.Осылайша, спецификалық емес өнімдер ПТР реакциясын дайындау кезінде және термиялық циклдің басында ұстау температурасы жасыту температурасынан төмен болғанда өндіріледі.Қалыптасқаннан кейін бұл ерекше емес өнімдер тиімді түрде күшейтіледі.Праймерді жобалау үшін пайдаланылатын учаскелер генетикалық элементтердің орналасуымен, мысалы, сайтқа бағытталған мутациялар, экспрессиялық клондау немесе ДНҚ инженериясы үшін пайдаланылатын генетикалық элементтерді құру және манипуляциялау сияқты шектелген кезде ыстық басталатын ПТР әсіресе тиімді.
Taq ДНҚ полимеразасының белсенділігін шектеудің жалпы әдісі мұзда ПТР реакциясы ерітіндісін дайындау және оны алдын ала қыздырылған ПТР аппаратына орналастыру болып табылады.Бұл әдіс қарапайым және қымбат емес, бірақ ол ферменттің белсенділігін аяқтамайды, сондықтан спецификалық емес өнімдердің күшейтілуін толығымен жоя алмайды.
Термиялық прайминг ПТР аппараты денатурация температурасына жеткенше маңызды компонентті тежеу арқылы ДНҚ синтезін кешіктіреді.Қолмен термиялық инициациялау әдістерінің көпшілігі, соның ішінде Taq ДНҚ полимеразасының кешіктірілген қосылуы, әсіресе өнімділігі жоғары қолданбалар үшін қиын.Басқа термиялық праймерлеу әдістері магний иондарын немесе ферменттерді қоса алғанда, маңызды құрамдас бөлікті қоршау үшін немесе шаблондар мен буферлер сияқты реактивті компоненттерді физикалық оқшаулау үшін балауыз қалқанын пайдаланады.Термиялық цикл кезінде әртүрлі компоненттер шығарылады және балауыз еріген кезде араласады.Қолмен іске қосу әдісі сияқты, балауыздан қорғау әдісі ауыр және ластануға бейім және жоғары өткізу қабілеті бар қолданбалар үшін жарамсыз.
Платина ДНҚ полимеразасы ПТР автоматты түрде іске қосу үшін ыңғайлы және тиімді.Platinum Taq ДНҚ полимеразасы Taq DNA полимеразаға қарсы моноклоналды антиденемен біріктірілген рекомбинантты Taq ДНҚ полимеразасынан тұрады.Антиденелер температураны ұзақ ұстау кезінде ферменттердің белсенділігін тежеу үшін ПТР әдісімен тұжырымдалады.Так ДНҚ полимеразасы денатурация сатысын 94℃ оқшаулау кезінде реакцияға шығарылып, толық полимераза белсенділігін қалпына келтірді.Термиялық инициацияға арналған химиялық модификацияланған Taq ДНҚ полимеразасынан айырмашылығы, платина ферменті полимеразаны белсендіру үшін 94℃ (10-15 минут) температурада ұзақ оқшаулауды қажет етпейді.PlatinumTaq ДНҚ полимеразасымен Taq ДНҚ полимераза белсенділігінің 90% 94°С температурада 2 минуттан кейін қалпына келтірілді.
Алдын ала HS Taq ДНҚ полимеразасы
11. Nest-PCR
Кірістірілген праймерлерді пайдаланып күшейтудің дәйекті айналымдары ерекшелік пен сезімталдықты жақсарта алады.Бірінші раунд 15-тен 20 циклге дейінгі стандартты күшейту болып табылады.Бастапқы күшейту өнімінің шағын бөлігі 100-ден 1000-ға дейін сұйылтылған және 15-20 цикл үшін күшейтудің екінші айналымына қосылды.Немесе бастапқы күшейтілген өнімнің өлшемін гельді тазарту арқылы анықтауға болады.Кірістірілген праймер күшейтудің екінші раундында пайдаланылады, ол бірінші праймердің ішіндегі мақсатты реттілікпен байланыстыра алады.Кірістірілген ПТР қолдану бірнеше мақсатты сайттарды күшейту мүмкіндігін азайтады, себебі праймерлердің екі жинағын толықтыратын мақсатты тізбектер аз.Бірдей праймерлері бар циклдердің бірдей жалпы саны (30-дан 40-қа дейін) спецификалық емес жерлерді күшейтті.Кірістірілген ПТР шектелген мақсатты тізбектердің (мысалы, сирек mrnas) сезімталдығын арттырады және қиын ПТРС ерекшелігін жақсартады (мысалы, 5′ RACE).
12. Төмендейтін ПТР
Төмендеу ПТР ПТР алғашқы бірнеше циклі үшін қатаң күйдіру шарттарын пайдалану арқылы спецификалықты жақсартады.Цикл болжанған Tm мәнінен шамамен 5℃ жоғары жасыту температурасынан басталады, содан кейін жасыту температурасы Tm 5℃ төмен болғанша әрбір цикл 1℃-ден 2℃-ге дейін төмендейді.Ең жоғары гомологиясы бар тағайындалған үлгі ғана күшейтіледі.Бұл өнімдер келесі циклдерде кеңейтіліп, күшейтілген спецификалық емес өнімдерді алып тастайды.Төмендеу ПТР AFLP ДНҚ саусақ ізі сияқты праймер мен мақсатты үлгі арасындағы гомология дәрежесі белгісіз әдістер үшін пайдалы.
Қатысты ПТР жинақтары
2 × ПТР батырыTMМикс жүйесінің қарапайым ПТР Микс жүйесіне қарағанда ПТР ингибиторларына төзімділігі жоғары және әртүрлі күрделі үлгілердің ПТР күшейтуіне оңай төтеп бере алады.Бірегей реакция жүйесі және жоғары тиімді Taq Hero ПТР реакциясын күшейту тиімділігін, ерекшелігін және сезімталдығын жоғарылатады.
Күшейтудің жоғары тиімділігі
Оның 5'→3' ДНҚ-полимераза белсенділігі және 5'→3' экзонуклеаза белсенділігі бар, 3'→5' экзонуклеаза белсенділігі жоқ.
Нақты уақыттағы ПТР Easyᵀᴹ-SYBR Green I жинағы
Арнайы — оңтайландырылған буфер және ыстық басталатын Taq ферменті спецификалық емес күшейту мен праймер димерінің түзілуін болдырмайды.
Жоғары сезімталдық — үлгінің төмен көшірмелерін анықтай алады
Жинақ реакцияның күшейту тиімділігі мен ерекшелігін тиімді жақсарту үшін бірегей реакция жүйесімен біріктірілген Foregene кері транскрипцияның бірегей реагентін және Foregene HotStar Taq ДНҚ полимеразасын пайдаланады.
Жіберу уақыты: 09 мамыр 2023 ж
