• ПТР – аз мөлшердегі ДНҚ шаблонынан ДНҚ-ны күшейту үшін қолданылатын әдіс.RT-ПТР РНҚ көзінен ДНҚ үлгісін жасау үшін кері транскрипцияны пайдаланады, оны кейін күшейтуге болады.
• ПТР және RT-ПТР әдетте соңғы нүкте реакциялары болып табылады, ал qPCR және RT-qPCR бар үлгінің мөлшерін анықтау үшін ПТР реакциясы кезінде өнім синтезі жылдамдығының кинетикасын пайдаланады.
• Сандық ПТР сияқты жаңа әдістер бастапқы ДНҚ үлгісінің абсолютті сандық көрсеткіштерін қамтамасыз етеді, ал изотермиялық ПТР сияқты әдістер сенімді нәтижелерді қамтамасыз ету үшін қымбат жабдықты қажет етпейді.

Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) – ДНҚ мен РНҚ тізбегін күшейту және анықтау үшін салыстырмалы түрде қарапайым және кеңінен қолданылатын молекулалық биология әдісі.ДНҚ-ны клондау мен күшейтудің дәстүрлі әдістерімен салыстырғанда, бұл жиі бірнеше күнді алады, ПТР бірнеше сағатты қажет етеді.ПТР жоғары сезімтал және нақты тізбектерді анықтау және күшейту үшін минималды үлгіні қажет етеді.Негізгі ПТР әдістері қарапайым ДНҚ мен РНҚ анықтаудан әрі қарай жетілдірілді.Төменде біз әртүрлі ПТР әдістеріне және Enzo Life Sciences компаниясында сіздің зерттеу қажеттіліктеріңізге арналған реагенттерге шолу жасадық.Біз ғалымдарға келесі зерттеу жобасында пайдалану үшін ПТР реагенттеріне жылдам қол жеткізуге көмектесуді мақсат етеміз!

ПТР

Стандартты ПТР үшін сізге тек ДНҚ полимераза, магний, нуклеотидтер, праймерлер, күшейтілетін ДНҚ үлгісі және термоцикл қажет.ПТР механизмі оның мақсаты сияқты қарапайым: 1) қос тізбекті ДНҚ (dsDNA) жылумен денатуратталған, 2) праймерлер бір ДНҚ тізбектеріне тураланады және 3) праймерлер ДНҚ-полимераза арқылы ұзартылады, нәтижесінде ДНҚ екі көшірмесі пайда болады. бастапқы ДНҚ тізбегі.Температуралар мен уақыт қатарындағы денатурация, жасыту және ұзарту процесі күшейтудің бір циклі ретінде белгілі (1-сурет).

Циклдің әрбір қадамы пайдаланылатын үлгі мен праймер жинағы үшін оңтайландырылған болуы керек.Бұл цикл шамамен 20-40 рет қайталанады, содан кейін күшейтілген өнімді әдетте агароз гелі арқылы талдауға болады (Cурет 2).

ПТР жоғары сезімтал әдіс болғандықтан және бір реакциялар үшін өте аз көлемде қажет болғандықтан, бірнеше реакциялар үшін негізгі қоспаны дайындау ұсынылады.Негізгі қоспаны жақсылап араластырып, содан кейін реакциялар санына бөлу керек, бұл әрбір реакцияда бірдей мөлшерде фермент, dNTP және праймер болуын қамтамасыз ету керек.Enzo Life Sciences сияқты көптеген жеткізушілер сонымен қатар праймерлер мен ДНҚ үлгісінен басқаның барлығын қамтитын ПТР қоспаларын ұсынады.

Гуанинге/цитозинге бай (ГК-ға бай) аймақтар стандартты ПТР әдістеріне қиындық тудырады.GC-ге бай тізбектер GC мазмұны төмен тізбектерге қарағанда тұрақтырақ.Сонымен қатар, GC-қа бай тізбектер шаш қыстырғыштары сияқты қайталама құрылымдарды қалыптастыруға бейім.Нәтижесінде денатурация фазасында ГК-ға бай қос жіптерді толық ажырату қиын.Демек, ДНҚ-полимераза жаңа тізбекті кедергісіз синтездей алмайды.Жоғары денатурация температурасы мұны жақсартады, ал жоғары жасыту температурасына және қысқа күйдіру уақытына қарай түзетулер GC-қа бай праймерлердің спецификалық емес байланысуын болдырмайды.Қосымша реагенттер GC-қа бай тізбектердің күшейтілуін күшейте алады.DMSO, глицерин және бетаин GC өзара әрекеттесуінен туындаған қайталама құрылымдарды бұзуға көмектеседі және осылайша қос жіптердің бөлінуін жеңілдетеді.

Ыстық бастау ПТР

Белгісіз күшейту - ПТР кезінде туындауы мүмкін мәселе.ПТР үшін қолданылатын ДНҚ-полимеразалардың көпшілігі шамамен 68°C және 72°C температурада жақсы жұмыс істейді.Алайда, фермент төменгі температурада да белсенді болуы мүмкін, бірақ төменірек.Жасыту температурасынан әлдеқайда төмен температураларда праймерлер спецификалық емес байланысып, тіпті реакция мұзда орнатылған болса да, спецификалық емес күшейтуге әкелуі мүмкін.Мұны белгілі бір температураға жеткенде ғана ДНҚ-полимеразадан диссоциацияланатын полимераз ингибиторларын қолдану арқылы болдырмауға болады, демек ыстық бастау ПТР термині.Тежегіш полимеразаны байланыстыратын және бастапқы денатурация температурасында (әдетте 95°C) денатурацияланатын антидене болуы мүмкін.

Жоғары дәлдіктегі полимераза

ДНҚ-полимеразалар бастапқы үлгі тізбегіне жеткілікті дәл күшейтілгенімен, нуклеотидтерді сәйкестендіруде қателер болуы мүмкін.Клондау сияқты қолданбалардағы сәйкессіздіктер қысқартылған транскрипттерге және төмен ағында қате аударылған немесе белсенді емес ақуыздарға әкелуі мүмкін.Осы сәйкессіздіктерді болдырмау үшін «түзету» белсенділігі бар полимеразалар анықталып, жұмыс үрдісіне енгізілді.Алғашқы түзетуші полимераза Pfu 1991 жылы Pyrococcus furiosus-та анықталған.Бұл Pfu ферментінің экзонуклеаза белсенділігі 3'-тен 5'ке дейін.ДНҚ күшейтілген кезде экзонуклеаза жіптің 3' соңындағы сәйкес келмейтін нуклеотидтерді жояды.Содан кейін дұрыс нуклеотид ауыстырылады және ДНҚ синтезі жалғасады.Дұрыс емес нуклеотидтер тізбегін анықтау ферментпен дұрыс нуклеозидтрифосфатпен байланысуға жақындығына негізделген, мұнда тиімсіз байланысу синтезді баяулатады және дұрыс ауыстыруға мүмкіндік береді.Pfu полимеразасының түзету белсенділігі Taq ДНҚ полимеразасымен салыстырғанда соңғы реттіліктегі қателерді азайтады.Соңғы жылдары басқа да тексеретін ферменттер анықталды және ДНҚ күшейту кезінде қателік деңгейін одан әрі азайту үшін бастапқы Pfu ферментінің модификациялары жасалды.

RT-ПТР

Кері транскрипциялық ПТР немесе RT-ПТР үлгі ретінде РНҚ пайдалануға мүмкіндік береді.Қосымша қадам РНҚ-ны анықтауға және күшейтуге мүмкіндік береді.РНҚ кері транскриптазаның көмегімен комплементарлы ДНҚ-ға (cDNA) кері транскрипцияланады.РНҚ үлгісінің сапасы мен тазалығы RT-ПТР сәтті болуы үшін маңызды.RT-ПТР бірінші қадамы ДНҚ/РНҚ гибридінің синтезі болып табылады.Кері транскриптазада гибридтің РНҚ бөлігін бұзатын RNase H функциясы да бар.Содан кейін бір тізбекті ДНҚ молекуласы кері транскриптазаның кДНҚ-ға ДНҚ-ға тәуелді ДНҚ-полимераза белсенділігі арқылы аяқталады.Бірінші тізбекті реакцияның тиімділігі күшейту процесіне әсер етуі мүмкін.Осы жерден кДНҚ-ны күшейту үшін стандартты ПТР процедурасы қолданылады.RT-ПТР арқылы РНҚ-ны кДНҚ-ға қайтару мүмкіндігі көптеген артықшылықтарға ие және ол ең алдымен ген экспрессиясын талдау үшін қолданылады.РНҚ бір тізбекті және өте тұрақсыз, бұл онымен жұмыс істеуді қиындатады.Ол әдетте биологиялық үлгідегі РНҚ транскрипттерінің санын анықтайтын qPCR-да бірінші қадам ретінде қызмет етеді.

qPCR және RT-qPCR

Сандық ПТР (qPCR) көптеген қолданбалар үшін нуклеин қышқылдарын анықтау, сипаттау және сандық анықтау үшін қолданылады.RT-qPCR-де РНҚ транскрипттері көбінесе жоғарыда сипатталғандай алдымен оларды cDNA-ға кері транскрипциялау арқылы сандық түрде анықталады, содан кейін qPCR кейіннен жүзеге асырылады.Стандартты ПТР сияқты ДНҚ үш қайталанатын қадаммен күшейтіледі: денатурация, жасыту және ұзарту.Дегенмен, qPCR жүйесінде флуоресцентті таңбалау ПТР барысында деректерді жинауға мүмкіндік береді.Бұл әдіс көптеген әдістер мен химиялық заттарға байланысты көптеген артықшылықтарға ие.

Бояуға негізделген qPCR (әдетте жасыл) флуоресцентті таңбалау dsDNA байланыстыратын бояғышты пайдалану арқылы күшейтілген ДНҚ молекулаларының санын анықтауға мүмкіндік береді.Әрбір цикл кезінде флуоресценция өлшенеді.Флуоресценция сигналы репликацияланған ДНҚ мөлшеріне пропорционалды түрде артады.Демек, ДНҚ «нақты уақытта» сандық түрде анықталады (3-сурет).Бояуға негізделген qPCR кемшіліктері бір уақытта тек бір нысананы зерттеуге болады және бояу үлгіде бар кез келген ds-DNA-мен байланысады.

Зондқа негізделген qPCR-де әр үлгіде көптеген нысандарды бір уақытта анықтауға болады, бірақ бұл праймерлерге қосымша пайдаланылатын мақсатқа арнайы зонд(тарды) оңтайландыруды және жобалауды талап етеді.Зонд конструкцияларының бірнеше түрі бар, бірақ ең көп тараған түрі флюорофор мен сөндіргішті біріктіретін гидролиздік зонд болып табылады.Флуоресценциялық резонансты энергияны тасымалдау (FRET) зонд бүтін болған кезде сөндіруші арқылы флюорофордың шығарылуын болдырмайды.Дегенмен, ПТР реакциясы кезінде зонд праймерді ұзарту және ол байланыстырылған нақты тізбекті күшейту кезінде гидролизденеді.Зондтың бөлінуі флюорофорды сөндіргіштен ажыратады және флуоресценцияның күшейтуге байланысты жоғарылауына әкеледі (4-сурет).Осылайша, зонд негізіндегі qPCR реакциясының флуоресценция сигналы үлгіде бар зондтың мақсатты реттілігінің мөлшеріне пропорционал.Зонд негізіндегі qPCR бояуға негізделген qPCR қарағанда ерекше болғандықтан, бұл көбінесе qPCR негізіндегі диагностикалық талдауларда қолданылатын технология.

Изотермиялық күшейту

Жоғарыда аталған ПТР әдістері денатурация, жасыту және ұзарту қадамдары үшін камераның температурасын жоғары және төмен дәл көтеру үшін қымбат термоциклдік жабдықты қажет етеді.Мұндай дәл құрылғыларды қажет етпейтін және қарапайым су моншасында немесе тіпті қызығушылық тудыратын ұяшықтардың ішінде орындалуы мүмкін бірқатар әдістер әзірленді.Бұл әдістер жалпы түрде изотермиялық күшейту деп аталады және экспоненциалды, сызықтық немесе каскадтық күшейтуге негізделген.

Изотермиялық күшейтудің ең танымал түрі - цикл арқылы изотермиялық күшейту немесе LAMP.LAMP үлгі ДНҚ немесе РНҚ күшейту үшін 65⁰C температурада экспоненциалды күшейтуді пайдаланады.LAMP орындау кезінде мақсатты ДНҚ аймақтарына қосымша төрт-алты праймер жаңа ДНҚ синтездеу үшін ДНҚ-полимеразамен бірге пайдаланылады.Осы праймерлердің екеуінде басқа праймерлердегі реттіліктерді танитын және оларды байланыстыратын қосымша реттіліктері бар, бұл жаңадан синтезделген ДНҚ-да «цикл» құрылымын қалыптастыруға мүмкіндік береді, содан кейін күшейтудің келесі раундтарында праймерді жасытуға көмектеседі.LAMP флуоресценция, агарозды гель электрофорезі немесе колориметрияны қоса алғанда, көптеген әдістермен бейнеленуі мүмкін.Колориметрия арқылы өнімнің болуын немесе жоқтығын визуализациялау және анықтаудың қарапайымдылығы және қымбат жабдықтың болмауы LAMP-ті клиникалық зертханалық сынақтар оңай қол жетімді емес жерлерде SARS-CoV-2 сынағы немесе үлгілерді сақтау және тасымалдау үшін қолайлы нұсқаға айналдырды. мүмкін емес немесе бұрын ПТР термоциклдік жабдығы жоқ зертханаларда.