Дәстүрлі кері транскриптазалар жоғары температураға шыдамайды (MMLV белсенділігі үшін оңтайлы температура 37-50°С, ал AMV 42-60°С).Неғұрлым күрделі вирустық РНҚ төмен температурада кДНҚ-ға кері транскрипциялануы мүмкін емес, нәтижесінде анықтау тиімділігі төмендейді.Дәстүрлі RT-qPCR әдетте екі негізгі ферменттің (кері транскриптаза және ДНҚ полимераза) қатысуын талап етеді, бұл реакция жүйесінің жұмысын жеңілдету және шығынды азайту мүмкін емес.Мұнда біз жоғары температураға төзімді екі кері транскриптазаны, TtH және RevTaq енгіземіз.Бұл екі фермент ДНҚ-полимераза қызметін де атқарады, сондықтан оларды бифункционалды ферменттер деп атайды.

TtH ДНҚ полимераза

Сіз термофильді Thermus thermophilus HB8 бактериясынан алынған TtH туралы естіген болуыңыз керек.Mg2+ сияқты екі валентті катиондардың қатысуымен ДНҚ-полимераза белсенділігі бар.Ол Taq ферменті сияқты ПТР реакцияларында кеңінен қолданылады, бірақ ол Taq ферментіне қарағанда жоғары ыстыққа төзімділікке ие, сондықтан ол GC мазмұны жоғары үлгілері бар ПТР-ге жақсы әсер етеді.

· Бұл ферментте негізінен 3′→5′ экзонуклеаза белсенділігі және 5′→3′ экзонуклеаза белсенділігі жоқ, сондықтан оны дидеоксиді секвенирлеу үшін де қолдануға болады.

· Бұл ферменттің RTase белсенділігі бар.Mn2+ болған жағдайда RTase белсенділігі артады.Бұл мүмкіндікті пайдалана отырып, оны бір түтікте кері транскрипция реакциясын және ПТР реакциясын, яғни бір сатылы RT-ПТР орындау үшін пайдалануға болады.Бірақ Mn2+ болған жағдайда RT-ПТР дәлдігі жоғары емес.RT белсенділігінің rnaase H белсенділігіне ешқандай қатысы жоқ.

· Tth-ДНҚ полимеразасының жоғарылау белсенділігі (pH9, оңтайлы +55℃～+70℃, максимум +95℃) РНҚ қайталама құрылымынан туындаған мәселелерді жеңеді.Алынған кДНҚ-ны Mg2+ иондарының қатысуымен бірдей ферментпен ПТР арқылы күшейтуге болады.

· Tth-ДНҚ полимеразаның кері транскрипцияны және жоғары температурада ДНҚ күшейтуін орындау қабілеті бұл ферментті сандық RT-ПТР, клондау және жасушалық және вирустық РНҚ-ның ген экспрессиясын талдау үшін пайдалы етеді.
· Тт-ДНҚ полимераза RT-ПТР үшін РНҚ-ны 1кб дейін күшейту үшін қолданылады.

Ерекшеліктер мен артықшылықтар

Tth ДНҚ полимеразасы:

• Оңтайландырылған полимеразды тізбекті реакция (ПТР) өнім өлшемін, RT-ПТР реакциясында кемінде 1000 б.

• Модификацияланған дезоксирибонуклеозидтрифосфатты субстрат ретінде қабылдаңыз

• RNase H белсенділігіне қатысы жоқ

• Әдетте РНҚ-дағы жоғары қайталама құрылыммен байланысты мәселелерді шешу үшін жоғары термиялық тұрақтылыққа ие

RevTaq RT-ПТР ДНҚ полимеразасы

Кері транскриптаза белсенділігі бар ыстыққа төзімді ДНҚ-полимераза

RevTaq-RT-PCR-ДНҚ полимеразасы бағытталған және жасанды эволюция арқылы алынған кері транскриптаза және ДНҚ полимераза белсенділігі бар инженерлік, жоғары ыстыққа төзімді, қос функционалды фермент.

· 95°C температурада RevTaq RT-ПТР ДНҚ полимеразасының жартылай шығарылу кезеңі 40 минуттан асады.

· RevTaq RT-PCR ДНҚ полимеразасы РНҚ үлгісінен тікелей жоғары температурадағы кері транскрипцияға мүмкіндік береді, ал кері транскрипция қадамы көбірек cDNA үлгілерін жасау үшін бірнеше рет қайталануы мүмкін.

· RevTaq RT-ПТР ДНҚ полимеразасы «нөлдік қадам» RT-ПТР (изотермиялық кері транскрипция қадамы жоқ) мүмкіндік береді, өйткені циклдік ПТР кеңейту қадамында кері транскрипция және ДНҚ күшейту бір уақытта жүреді.Бұл сонымен қатар жоғары температурада кері транскрипция реакциясына ықпал етеді, осылайша жоғары температурада РНҚ-дағы күшті қайталама құрылымды балқыту кезінде кездесетін проблемаларды азайтады.

· Аптамер негізіндегі ыстық бастау формуласының арқасында RevTaq RT-ПТР ДНҚ полимераза жасыту және ұзарту температурасы 57°C жоғары болғанда жақсы нәтиже береді.

· Фермент ыстыққа төзімді болғандықтан, балқу температурасы өте жоғары (>60°C) праймерлер мен зондтарды жобалау ұсынылады.

· Реакцияны орнату процесі кезінде температура градиенті арқылы жасыту/ұзарту қадамының температурасын оңтайландыру ұсынылады.

· Температура жоғары болған сайын ПТР ерекшелігі жоғары болады.Кері транскрипция циклі әдетте ПТР цикліне қарағанда жоғары температурада орындалады, өйткені DNA Primer:RNA Template будандастыру әдетте DNA Primer:cDNA Template дуплексіне қарағанда жоғары балқу температурасына ие.

· RevTaq RT-ПТР ДНҚ полимеразасы гендік-инженерленген және оңтайландырылған және ампликон өлшемі 60-300 бит.

RevTaq RT-ПТР ДНҚ полимеразасын анықтау шегі 4 көшірмеге жетеді/

Оңтайландырылған реакция жүйесі (жоғары балқу температурасы праймерлерді орнату) суретте көрсетілген.RevTaq RT-PCR ДНҚ полимеразасымен басқарылатын RT-ПТР TaqPath 1-қадамды RT-qPCR негізгі қоспасына қарағанда жақсы сезімталдықты және үлгі сұйылту градиенті төмен анықтауды көрсетеді.

Қосымша артықшылықтар:

Жылдам бастау функциясы → Бастапқы термиялық денатурация қадамын өткізіп жіберуге болады.

Ыстық іске қосу аптамер формуласы → 100% фермент белсенділігін дереу қамтамасыз етіңіз және төмен температурада (<57°C) спецификалық емес күшейтуді болдырмаңыз.

Бөліну функциясы → РНҚ экстракциясы қадамы өткізілмейді, өйткені RevTaq RT-ПТР ДНҚ полимеразасы шикі реакция үлгілерін де өңдей алады.Ол ыстық RT-ПТР циклінде эукариоттардың, бактериялардың және вирустардың жасушалық мембраналарын дереу бұза алады.

IVD шикізат деңгейі → жоғары сапа стандарттары және өте бәсекеге қабілетті бағалар