1. Негізгі білім (егер эксперименттік бөлімді көргіңіз келсе, тікелей екінші бөлікке көшіріңіз)
Кәдімгі ПТР туынды реакциясы ретінде Нақты уақыттағы ПТР негізінен флуоресценция сигналының өзгеруі арқылы нақты уақытта ПТР күшейту реакциясының әрбір цикліндегі күшейту өнімі мөлшерінің өзгеруін бақылайды және ct мәні мен стандартты қисық арасындағы байланыс арқылы бастапқы шаблонды сандық түрде талдайды.
RT-ПТР нақты деректер болып табыладыбазалық, флуоресценция шегіжәнеCt мәні.
| негізгі: | 3-15-ші циклдің флуоресценттік мәні өлшеудің кездейсоқ қателігінен туындайтын негізгі (базалық) болып табылады. |
| Табалдырық (табалдырық): | Күшейту қисығының экспоненциалды өсу аймағындағы сәйкес позицияда орнатылған флуоресценцияны анықтау шегіне жатады, әдетте негізгі сызықтың стандартты ауытқуынан 10 есе. |
| КТ мәні: | Бұл әрбір реакция түтігіндегі флуоресценция мәні шекті мәнге жеткен кездегі ПТР циклдарының саны. Ct мәні бастапқы үлгінің көлеміне кері пропорционал. |
RT-ПТР үшін жалпы таңбалау әдістері:
| әдіс | артықшылығы | кемшілік | қолдану аясы |
| SYBR GreenⅠ | Қолдану мүмкіндігі кең, сезімтал, арзан және ыңғайлы | Праймерге қойылатын талаптар жоғары, спецификалық емес жолақтарға бейім | Ол әртүрлі мақсатты гендердің сандық талдауына, гендердің экспрессиясын зерттеуге және трансгенді рекомбинантты жануарлар мен өсімдіктерді зерттеуге жарамды. |
| TaqMan | Жақсы ерекшелік және жоғары қайталану | Бағасы жоғары және тек нақты мақсаттарға жарамды. | Патогенді анықтау, дәріге төзімділік генін зерттеу, дәрілік заттардың тиімділігін бағалау, генетикалық ауруларды диагностикалау. |
| молекулалық маяк | Жоғары ерекшелік, флуоресценция, төмен фон | Бағасы жоғары, ол белгілі бір мақсатқа ғана жарамды, дизайны қиын, бағасы жоғары. | Спецификалық гендік талдау, SNP талдауы |
2. Эксперименттік қадамдар
2.1 Эксперименттік топтастыру туралы- топта бірнеше ұңғыма болуы керек және биологиялық қайталаулар болуы керек.
| ① | Бос бақылау | Тәжірибелерде жасуша өсу күйін анықтау үшін қолданылады |
| ② | Теріс бақылау siRNA (спецификалық емес siRNA тізбегі) | RNAi әрекетінің ерекшелігін көрсетіңіз.siRNA 200 нМ концентрациясында спецификалық емес стресс реакциясын тудыруы мүмкін. |
| ③ | Трансфекциялық реактивті бақылау | Трансфекция реагентінің жасушаларға уыттылығын немесе мақсатты геннің экспрессиясына әсерін жоққа шығарыңыз |
| ④ | siRNA мақсатты генге қарсы | Мақсатты геннің экспрессиясын бұзыңыз |
| ⑤ (міндетті емес) | оң сиРНҚ | Эксперименттік жүйе және операциялық ақауларды жою үшін қолданылады |
| ⑥ (міндетті емес) | Флуоресцентті басқару siRNA | Жасуша трансфекциясының тиімділігін микроскоппен байқауға болады |
2.2 Праймерді жобалау принциптері
| Күшейтілген фрагмент өлшемі | Жақсырақ 100-150 бит |
| Праймер ұзындығы | 18-25б |
| GC мазмұны | 30%-70%, жақсырақ 45%-55% |
| Tm мәні | 58-60℃ |
| Жүйелі | Үздіксіз T/C болдырмау;A/G үздіксіз |
| 3 соңғы реттілік | GC rich немесе AT rich қолданбаңыз;терминал негізі жақсырақ G немесе C;Т-дан аулақ болған дұрыс |
| Толықтауыш | Праймер ішінде немесе екі праймер арасында 3-тен астам негіздің қосымша реттілігін болдырмаңыз |
| Ерекшелік | Праймер ерекшелігін растау үшін жарылыс іздеуді пайдаланыңыз |
①SiRNA түрге тән және әртүрлі түрлердің реттілігі әртүрлі болады.
②SiRNA мұздатылған кептірілген ұнтаққа оралған, оны бөлме температурасында 2-4 апта бойы тұрақты сақтауға болады.
2.3 Алдын ала дайындалуы керек құралдар немесе реактивтер
| Праймер (ішкі анықтама) | Соның ішінде алға және кері екі |
| Праймерлер (мақсатты ген) | Соның ішінде алға және кері екі |
| Мақсатты Si РНҚ (3 жолақ) | Жалпы, компания 3 жолақты синтездейді, содан кейін RT-PCR арқылы үш жолақтың біреуін таңдайды. |
| Трансфекция жинағы | Lipo2000 т.б. |
| РНҚ жылдам экстракция жинағы | Трансфекциядан кейін РНҚ экстракциясы үшін |
| Жылдам кері транскрипция жинағы | кДНҚ синтезі үшін |
| ПТР күшейту жинағы | 2×Super SYBR жасыл qPCR Master Mix |
2.4 Нақты эксперименттік кезеңдерде назар аударуды қажет ететін мәселелерге қатысты:
①siRNA трансфекция процесі
1. Қабаттау үшін 24 шұңқырлы пластинаны, 12 шұңқырлы немесе 6 шұңқырлы пластинаны таңдай аласыз (24 шұңқырлы пластинаның әрбір шұңқырында ұсынылатын орташа РНҚ концентрациясы шамамен 100-300 нг/uL) және жасушалардың оңтайлы трансфекция тығыздығы 60%-80% немесе одан да көп.
2. Трансфекция қадамдары мен нақты талаптар нұсқауларға қатаң сәйкес келеді.
3. Трансфекциядан кейін үлгілерді мРНҚ анықтау (RT-ПТР) немесе 48-96 сағат ішінде ақуызды анықтау (ВБ) үшін 24-72 сағат ішінде жинауға болады.
② РНҚ экстракция процесі
1. Экзогендік ферменттермен ластануды болдырмау.Ол негізінен маскалар мен қолғаптарды қатаң түрде киюді қамтиды;стерильденген тамшуыр ұштарын және EP түтіктерін пайдалану;тәжірибеде қолданылатын су RNase-сіз болуы керек.
2. Тазалық пен өнімді шынымен жақсартатын жылдам экстракция жинағында ұсынылғандай екі рет орындау ұсынылады.
3. Қалдық сұйықтық РНҚ бағанына тиіп кетпеуі керек.
③ РНҚ мөлшерін анықтау
РНҚ алынғаннан кейін оны тікелей Nanodrop көмегімен анықтауға болады және ең аз көрсеткіш 10 нг/ул дейін төмен болуы мүмкін.
④кері транскрипция процесі
1. RT-qPCR жоғары сезімталдығына байланысты, кейінгі Ct тым әртүрлі болуын немесе статистикалық талдау үшін SD тым үлкен болуын болдырмау үшін әрбір үлгі үшін кемінде 3 параллель ұңғыма жасау керек.
2. Мастер миксті қайта-қайта мұздатуға және ерітуге болмайды.
3. Әрбір түтік/тесік жаңа ұшымен ауыстырылуы керек!Үлгілерді қосу үшін бір тамшуыр ұшын үздіксіз пайдаланбаңыз!
4. Үлгіні қосқаннан кейін 96 шұңқырлы пластинаға бекітілген пленканы пластинамен тегістеу керек.Түтік қабырғасындағы сұйықтық төмен қарай ағып, ауа көпіршіктерін кетіруі үшін оны құрылғыға қоймас бұрын центрифугалаған дұрыс.
⑤Жалпы қисық талдау
| Логарифмдік өсу периоды жоқ | Үлгінің жоғары концентрациясы болуы мүмкін |
| КТ мәні жоқ | Флуоресцентті сигналдарды анықтаудың қате қадамдары; праймерлердің немесе зондтардың деградациясы – оның тұтастығын PAGE электрофорезі арқылы анықтауға болады; үлгінің жеткіліксіз мөлшері; шаблондардың деградациясы – қоспаларды енгізуді және үлгіні дайындау кезінде қайталап мұздату мен ерітуді болдырмау; |
| Ct>38 | Күшейтудің төмен тиімділігі;ПТР өнімі тым ұзын;әртүрлі реакция компоненттері бұзылады |
| Сызықтық күшейту қисығы | Зондтар қайталанатын мұздату-еріту циклдары немесе жарыққа ұзақ әсер ету арқылы ішінара тозуы мүмкін. |
| Қайталанатын саңылаулардағы айырмашылық әсіресе үлкен | Реакциялық ерітінді толық балқымаған немесе реакция ерітіндісі араласпаған;ПТР құралының термиялық ваннасы флуоресцентті заттармен ластанған |
2.5 Деректерді талдау туралы
qPCR деректер талдауын салыстырмалы сандық және абсолютті сандық анықтауға бөлуге болады.Мысалы, емдеу тобындағы жасушалар бақылау тобындағы жасушалармен салыстырғанда,
Х генінің мРНҚ қанша рет өзгерсе, бұл салыстырмалы сандық анықтау;жасушалардың белгілі бір санында X генінің мРНҚ
Қанша көшірме бар, бұл абсолютті сандық көрсеткіш.Әдетте біз зертханада ең көп қолданатын нәрсе салыстырмалы сандық әдіс.Әдетте,2-ΔΔct әдісітәжірибелерде ең көп қолданылады, сондықтан мұнда тек осы әдіс егжей-тегжейлі енгізілетін болады.
2-ΔΔct әдісі: Алынған нәтиже бақылау тобындағы мақсатты генге қатысты эксперименттік топтағы мақсатты геннің экспрессиясының айырмашылығы болып табылады.Мақсатты геннің де, ішкі референттік геннің де күшейту тиімділігі 100%-ға жақын болуы талап етіледі, ал салыстырмалы ауытқу 5%-дан аспауы керек.
Есептеу әдісі келесідей:
Δct бақылау тобы = бақылау тобындағы мақсатты геннің ct мәні – бақылау тобындағы ішкі анықтамалық геннің ct мәні
Δct эксперименталды топ = эксперименталды топтағы мақсатты геннің ct мәні – эксперименталды топтағы ішкі референттік геннің ct мәні
ΔΔct=Δct эксперименттік топ-Δct бақылау тобы
Соңында, өрнек деңгейіндегі айырмашылықтың еселігін есептеңіз:
Fold=2-ΔΔct мәнін өзгерту (excel функциясына сәйкес келетін POWER)
Қосымша тауарлар:
Жіберу уақыты: 20 мамыр 2023 жыл
