Ⅰ. Реакция жүйесінің сезімталдығын арттыру:
1. Жоғары сапалы РНҚ бөліңіз:
Табысты cDNA синтезі жоғары сапалы РНҚ-дан келеді.Жоғары сапалы РНҚ кем дегенде жалпы ұзақтығын қамтамасыз етуі керек және құрамында EDTA немесе SDS сияқты тіркеуші ферменттер жоқ ингибиторлар болмауы керек.РНҚ сапасы cDNA-ға транскрипциялауға болатын реттілік ақпаратының максималды мәнін анықтайды.Жалпы РНҚ тазарту әдісі изооцианат/ацидофенолды қолданудың сатылы әдісі болып табылады.RNase-ның ластануын болдырмау үшін RNase-ға бай үлгіден (мысалы, ұйқы безі) бөлінген РНҚ жоғары сапалы РНҚ-ны сақтау үшін формальдегидті сақтауды қажет етеді, бұл ұзақ мерзімді сақтау үшін одан да көп.Егеуқұйрықтың бауырынан алынған РНҚ суда бір апта сақтаудан кейін негізінен бұзылды, ал егеуқұйрықтың көкбауырынан алынған РНҚ суда үш жыл сақтаудан кейін тұрақты болып қалды.Сонымен қатар, көлемі 4 кб-тан асатын транскрипттер шағын транскрипттерге қарағанда RNase деградациясының ізіне сезімталырақ.Сақтау РНҚ үлгісінің тұрақтылығын арттыру үшін РНҚ ионның метальмаминінде ерітілуі мүмкін және -70 ° C сақталады.РНҚ-ны сақтау үшін қолданылатын тилид құрамында РНҚ-ны бұзатын әртүрлі нысан болмауы керек.Ұйқы безінен алынған РНҚ кем дегенде бір жыл бойы метальмаминде сақталуы мүмкін.РНҚ-ны қолдануға дайын болғанда, РНҚ-ны тұндыру үшін келесі әдістерді қолдануға болады: 0,2м және этанолдың 4 есе көлеміне NaCl қосыңыз, бөлме температурасын 3-5 минутқа және 10 000 × г центрифуганы 5 минутқа қойыңыз.
2. RNaseH белсенділігінсіз кері транскриптазаны қолданыңыз (RNaseH-):
КДНҚ синтезінің ұзақтығы мен шығымдылығын арттыру үшін кері транскрипция реакцияларына RNase ингибиторлары жиі қосылады.RNase ингибиторы бірінші тізбекті синтез реакциясына буферлер мен DTT сияқты қалпына келтіретін агенттердің қатысуымен қосылады, өйткені пре-cDNA синтезі процесі ингибиторды денатурациялайды, осылайша РНҚ-ны ыдырататын байланысқан РНҚ-ларды босатады.Протеин RNase ингибиторы тек RNAse A, B, C арқылы РНҚ-ның ыдырауын болдырмайды және теріге РНазаларды болдырмайды, сондықтан бұл ингибиторларды қолдануға қарамастан, саусақтардан RNase енгізбеу керек.
Кері транскриптаза РНҚ-ның кДНҚ-ға айналуын катализдейді.M-MLV және AMV екеуі де өздерінің полимеразалық белсенділігіне қосымша эндогендік RNaseH белсенділігіне ие.RNaseH белсенділігі РНҚ шаблондары мен ДНҚ праймерлері немесе кДНҚ ұзартқыш тізбектері арасында түзілген гетерозиготалы тізбектер үшін полимераза белсенділігімен бәсекелеседі және РНҚ: ДНҚ кешендерінің РНҚ тізбектерін ыдыратады.RNaseH белсенділігімен ыдыраған РНҚ үлгілері бұдан былай кДНҚ синтезі үшін тиімді субстраттар ретінде қолданыла алмайды, бұл кДНҚ синтезінің шығымы мен ұзақтығын азайтады.Осылайша, кері транскриптазаның RNaseH белсенділігін жою немесе айтарлықтай төмендету үлкен пайда әкеледі.
SuperScriptⅡ кері транскриптаза, RNaseH-тің MMLV кері транскриптазасы және термоскрипт кері транскриптазасы, RNaseH-тің AMV-сы MMLV және AMV-ге қарағанда толық ұзындықтағы кДНҚ берді.RT-ПТР сезімталдығына синтезделген кДНҚ мөлшері әсер етеді.ThermoScript AMV-ге қарағанда әлдеқайда сезімтал.RT-ПТР өнімдерінің көлемі кері транскриптазаның cDNA синтездеу қабілетімен шектеледі, әсіресе үлкенірек Cdnas клондау кезінде.MMLV-мен салыстырғанда SuperScripⅡ ұзақ RT-ПТР өнімдерінің шығымдылығын айтарлықтай арттырды.RNaseH- кері транскриптазасы да термиялық тұрақтылықты арттырады, сондықтан реакцияны қалыптыдан 37-42℃ жоғары температурада жүргізуге болады.Ұсынылған синтез шарттарында олиго(dT) праймерлер және 10μCi [alpha-p]dCTP пайдаланылды.Бірінші тізбектің жалпы өнімі TCA жауын-шашын әдісімен есептелді.Толық ұзындықтағы cDNA өлшемі бойынша сұрыпталған жолақты жою және сілтілі агарозды гельде санау арқылы талданды.
3. Кері транскрипцияның жылу сақтау температурасын жоғарылатыңыз:
Жоғары ұстау температурасы РНҚ-ның қайталама құрылымын ашуға және реакция шығымдылығын арттыруға көмектеседі.РНҚ шаблондарының көпшілігі үшін РНҚ мен праймерді буферсіз немесе тұзсыз 65°C температурада ұстау, содан кейін оларды мұзда тез салқындату екінші реттік құрылымдардың көпшілігін жояды және праймерлердің байланысуына мүмкіндік береді.Дегенмен, кейбір шаблондар термиялық денатурациядан кейін де қайталама құрылымға ие.Бұл қиын үлгілерді күшейтуді күшейтуді жақсарту үшін ThermoScript кері транскриптазаны пайдаланып және кері транскриптаза реакциясын жоғары температурада орналастыру арқылы орындауға болады.Жоғарырақ ұстау температурасы, әсіресе, cDNA синтезі генге тән праймерлер (GSPS) арқылы орындалғанда, ерекшелікті арттыруы мүмкін (3-тарауды қараңыз).Егер GSP пайдаланылса, праймердің Tm мәні күтілетін ұстау температурасымен бірдей екеніне көз жеткізіңіз.Олиго(dT) және 60℃ жоғары кездейсоқ праймерлерді қолданбаңыз.Кездейсоқ праймерлерді 60 ℃ дейін көтермес бұрын 25℃ температурада 10 минут ұстау керек.Жоғары кері транскрипция температураларын қолданумен қатар, РНҚ/праймер қоспасын 65℃ денатурациялау температурасынан кері транскрипцияны ұстап тұру температурасына тікелей тасымалдау және алдын ала қыздырылған 2× реакция қоспасын (cDNA термиялық бастау синтезі) қосу арқылы ерекшелікті жақсартуға болады.Бұл тәсіл төмен температурада пайда болатын молекулааралық негіздердің жұптасуына жол бермеуге көмектеседі.ПТР құралын пайдалану RT-ПТР үшін қажетті көптеген температура қосқыштарын жеңілдетеді.
Tth жылу тұрақтандырылған полимераза Mg2+ қатысуымен ДНҚ полимераза және Mn2+ қатысуымен РНҚ полимераза ретінде әрекет етеді.Ол 65 ℃ дейін жылуды ұстай алады.Дегенмен, ПТР кезінде Mn2+ болуы сенімділікті төмендетеді, бұл Tth полимеразаны cDNA клондау сияқты жоғары дәлдіктегі күшейтуге жарамсыз етеді.Сонымен қатар, Tth кері транскрипцияда тиімділігі төмен, бұл сезімталдықты төмендетеді және бір фермент кері транскрипция мен ПТР орындай алатындықтан, кері транскрипциясы жоқ бақылау реакциялары кДНҚ-ның күшейтілген өнімдерін ластанған геномдық ДНҚ-дан ажырату үшін пайдаланыла алмайды.
4. Кері транскрипцияға ықпал ететін қоспа:
Бірінші тізбекті синтез реакциясына глицеринді және DMSO қоса алғанда қоспаларды қосу нуклеин қышқылының қос тізбегінің тұрақтылығын төмендетуі және РНҚ қайталама құрылымын босатуы мүмкін.SuperScriptⅡ немесе MMLV белсенділігіне әсер етпестен 20% дейін глицерин немесе 10% DMSO қосуға болады.AMV сонымен қатар белсенділікті төмендетпестен 20% глицеринге шыдай алады.SuperScriptⅡ кері транскрипция реакциясында RT-PCR сезімталдығын арттыру үшін 10% глицерин қосуға және 45℃ температурада оқшаулауға болады.Егер ПТР-ға ретротранскрипция-реакция өнімінің 1/10 бөлігі қосылса, күшейту реакциясындағы глицерин концентрациясы 0,4% құрайды, бұл ПТР тежеу үшін жеткіліксіз.
5. RNaseH өңдеу:
Сезімталдықты ПТР алдында cDNA синтез реакцияларын RNaseH көмегімен өңдеу арқылы жақсартуға болады.Кейбір үлгілер үшін cDNA синтез реакциясындағы РНҚ күшейтілген өнімдердің байланысуына кедергі жасайды деп есептеледі, бұл жағдайда RNaseH өңдеу сезімталдықты арттыруы мүмкін.Жалпы алғанда, RNaseH өңдеуі төмен көшірмені бар туберозды скерозⅡ сияқты салыстырмалы түрде ұзақ толық ұзындықты cDNA мақсатты үлгісін күшейту үшін қажет.Бұл қиын үлгі үшін RNaseH SuperScriptⅡ немесе AMV арқылы синтезделген cDNA арқылы жасалған сигналды күшейтті.RT-ПТР реакцияларының көпшілігі үшін RNaseH өңдеуі міндетті емес, себебі 95℃ оқшауланған ПТР денатурация қадамы әдетте РНҚ: ДНҚ кешенінен РНҚ гидролиздейді.
6. РНҚ-ның аз мөлшерін анықтаудың жетілдірілген әдістері:
RT-ПТР әсіресе аз мөлшерде РНҚ қол жетімді болған кезде өте қиын.РНҚ-ны бөлу кезінде тасымалдаушы ретінде гликогенді қосу шағын үлгілердің шығымдылығын арттыруға көмектеседі.РНазсыз гликогенді Тризолмен бір мезгілде қосуға болады.Гликоген суда ериді және келесі жауын-шашынға көмектесу үшін РНҚ бар су фазасында қалуы мүмкін.RNase жоқ гликогеннің ұсынылатын концентрациясы 50 мг тін немесе 106 өсірілген жасушадан аз үлгілер үшін 250 мкг/мл құрайды.
SuperScriptⅡ көмегімен кері транскрипция реакцияларына ацетилденген BSA қосу сезімталдықты арттыруы мүмкін, ал РНҚ-ның аз мөлшері үшін SuperScriptⅡ мөлшерін азайту және 40 бірлік RnaseOut нуклеаза тежегішін қосу анықтау деңгейін жақсартады.РНҚ бөлуде гликоген пайдаланылса, SuperScriptⅡ көмегімен кері транскрипция реакциялары үшін BSA немесе RNase тежегіштерін қосу әлі де ұсынылады.
Ⅱ. RT-ПТР ерекшелігін арттыру
1. cNDA синтезі:
Бірінші тізбекті кДНҚ синтезін бастау үшін үш түрлі әдісті қолдануға болады және әрбір әдістің салыстырмалы ерекшелігі синтезделген кДНҚ мөлшері мен түріне әсер етеді.
Кездейсоқ праймер әдісі үш әдістің ең аз ерекшелігі болып табылады.Қысқа, ішінара ұзындықтағы кДНҚ алу үшін праймерлер транскрипттің барлық жерінде бірнеше жерде жасытылған.Бұл әдіс көбінесе қайталама құрылымдық аймақтары бар немесе кері транскриптаза репликацияланбайтын аяқталатын учаскелері бар РНҚ үлгілерінен 5′ терминалдық тізбектер мен кДНҚ алу үшін қолданылады.Ең ұзын кДНҚ алу үшін әрбір РНҚ үлгісіндегі праймерлердің РНҚ-ға қатынасын эмпирикалық жолмен анықтау қажет.Кездейсоқ праймерлердің бастапқы концентрациясы 20 мкл реакция жүйесінде 50-ден 250 нг-ға дейін ауытқиды.Кездейсоқ праймерлер көмегімен жалпы РНҚ-дан синтезделген кДНҚ негізінен рибосомалық РНҚ болғандықтан, әдетте үлгі ретінде поли(А)+РНҚ таңдалады.
Олиго(dT) бастамасы кездейсоқ праймерлерге қарағанда ерекше.Ол эукариоттық жасушалардың көпшілігінде мРНҚ-ның 3′ ұшында орналасқан поли(А) құйрығымен будандастырады.Поли(А)+РНҚ жалпы РНҚ-ның шамамен 1%-дан 2%-ға дейінгісін құрайтындықтан, cDNA мөлшері мен күрделілігі кездейсоқ праймерлер пайдаланылғанға қарағанда әлдеқайда аз.Олиго(dT) өзінің жоғары ерекшелігіне байланысты, әдетте, РНҚ-ға праймер қатынасын және поли(А)+ таңдауын оңтайландыруды қажет етпейді.20 мкл реакция жүйесіне 0,5 мкг олиго(дТ) қолдану ұсынылады.oligo(dT)12-18 көптеген RT-ПТР үшін қолайлы.ThermoScript RT-PCR жүйесі жақсы термиялық тұрақтылығының арқасында олиго(dT)20 қамтамасыз етеді және жоғарырақ ұстау температурасына жарамды.
Гене-спецификалық праймерлер (GSP) кері транскрипция қадамы үшін ең жақсы арнайы праймерлер болып табылады.GSP – кездейсоқ праймерлер немесе олиго(dT) сияқты барлық Рналарды күйдірудің орнына, РНҚ тағайындау ретімен будандастыруға болатын антисенс олигонуклеозид.ПТР праймерлерін жобалау үшін қолданылатын ережелер кері транскрипция реакциясының GSP жобасына да қолданылады.GSP mRNA3′ соңында жасытылған күшейту праймерімен бірдей реттілік болуы мүмкін немесе GSP кері күшейту праймерімен төменгі ағынмен жасыту үшін жобалануы мүмкін.Кейбір күшейтілген нысандар үшін RT-ПТР сәтті өтуі үшін бірнеше антисенсті праймерді жобалау қажет, себебі мақсатты РНҚ-ның қайталама құрылымы праймердің байланысуына кедергі келтіруі мүмкін.20 мкл бірінші тізбекті синтез реакциясы жүйесінде 1пмоль антисенс GSP қолдану ұсынылады.
2. Кері транскрипцияның жылу сақтау температурасын жоғарылатыңыз:
GSP ерекшелігін толық пайдалану үшін жоғары термиялық тұрақтылығы бар кері транскриптазаны пайдалану керек.Ыстыққа тұрақты кері транскриптаза реакцияның қатаңдығын арттыру үшін жоғары температурада оқшаулануы мүмкін.Мысалы, егер GSP 55°C күйдірілген болса, онда кері транскрипция AMV немесе M-MLV көмегімен төмен қатаңдықпен 37°C орындалса, GSP ерекшелігі толық пайдаланылмайды.Дегенмен, SuperScripⅡ және ThermoScript 50℃ немесе одан жоғары температурада әрекет ете алады, бұл төмен температурада өндірілетін ерекше емес өнімдерді жояды.Максималды ерекшелік үшін РНҚ/праймер қоспасын 65℃ денатурация температурасынан кері транскрипцияны ұстап тұру температурасына алдын ала қыздырылған 2 x реакция қоспасын қосу арқылы тікелей тасымалдауға болады (cDNA синтезінің термиялық бастамасы).Бұл төмен температурада молекулалар арасындағы негіздердің жұптасуына жол бермеуге көмектеседі.ПТР құралын пайдалану RT-ПТР үшін қажетті көптеген температуралық ауысуларды жеңілдетеді.
3. Геномдық ДНҚ ластануын азайтыңыз:
RT-ПТР-дағы ықтимал қиындықтардың бірі РНҚ геномдық ДНҚ-ны ластауы болып табылады.Тризол реагенті сияқты РНҚ бөлудің жақсы әдістерін пайдалану РНҚ препараттарындағы геномдық ДНҚ ластануын азайтады.Геномдық ДНҚ-дан алынған өнімдерді болдырмау үшін кері транскрипциядан бұрын ластанған ДНҚ-ны жою үшін РНҚ-ны күшейту дәрежесі DnasⅠ көмегімен өңдеуге болады.Үлгілер DNaseⅠ қорытылуын тоқтату үшін 10 минут бойы 2,0 мм EDTA ішінде 65 ° C температурада ұсталды.ЭДТА жоғары температурада пайда болатын магний ионына тәуелді РНҚ гидролизінің алдын алу үшін магний иондарын хелаттайды.
Күшейтілген кДНҚ-ны геномдық ДНҚ күшейту өнімінен бөлу үшін бөлінген экзонмен бөлек күйдіретін праймерлер жобалануы мүмкін.cDNA-дан алынған ПТР өнімдері ластанған геномдық ДНҚ-дан алынғандарға қарағанда қысқа болады.Кері транскрипциясы жоқ бақыланатын эксперимент сонымен қатар берілген фрагменттің геномдық ДНҚ немесе кДНҚ екенін анықтау үшін әрбір РНҚ үлгісінде орындалады.Кері транскрипция болмаған жағдайда алынған ПТР өнімдері геномнан алынады.
Қатысты өнім
-Бір қадамдық жинақ кері транскрипция мен ПТР-ны бір түтікте жүргізуге мүмкіндік береді.Оған тек РНҚ шаблонын, арнайы ПТР праймерлерін және RNase-Free ddH қосу керек2O.
-РНҚ-ның нақты уақыттағы сандық талдауын тез және дәл жүргізуге болады.
-Жиындық реакцияның күшейту тиімділігі мен ерекшелігін тиімді жақсарту үшін бірегей реакция жүйесімен біріктірілген Foregene кері транскрипцияның бірегей реагентін және Foregene HotStar Taq ДНҚ полимеразасын пайдаланады.
-Оңтайландырылған реакция жүйесі реакцияның жоғары анықтау сезімталдығына, күшті термиялық тұрақтылыққа және жақсы төзімділікке ие етеді.
- Үлгідегі гДНҚ-ны 2 минут ішінде жоя алатын гДНҚ-ны жоюдың тиімді мүмкіндігі.
-Тиімді кері транскрипция жүйесі, бірінші cDNA тізбегінің синтезін аяқтау үшін небәрі 15 минут қажет.
-Күрделі үлгілер: жоғары GC мазмұны және күрделі қайталама құрылымы бар үлгілерді жоғары тиімділікпен өзгертуге болады.
-Жоғары сезімталдықты кері транскрипция жүйесі, pg деңгейіндегі үлгілер де жоғары сапалы cDNA ала алады.
- Кері транскрипция жүйесі жоғары термиялық тұрақтылыққа ие, оңтайлы реакция температурасы 42 ℃ және 50 ℃ температурада кері транскрипцияның жақсы өнімділігі бар.
Хабарлама уақыты: 07 наурыз 2023 ж
