一、реакция жүйесінің сезімталдығын арттыру:

1. Жоғары сапалы РНҚ изоляциясы:

Сәтті cDNA синтезі жоғары сапалы РНҚ-дан келеді.Жоғары сапалы РНҚ кем дегенде толық ұзындықта және EDTA немесе SDS сияқты кері транскриптаза тежегіштері болмауы керек.РНҚ сапасы cDNA-ға транскрипциялауға болатын реттілік ақпаратының максималды мөлшерін анықтайды.Жалпы РНҚ тазарту әдісі гуанидин-изотиоцианат/фенол қышқылын қолданатын бір сатылы әдіс болып табылады.RNase іздік мөлшерімен ластануды болдырмау үшін RNase-ға бай үлгілерден (ұйқы безі сияқты) оқшауланған РНҚ, әсіресе ұзақ мерзімді сақтау үшін жоғары сапалы РНҚ-ны сақтау үшін формальдегидте сақталуы керек.Егеуқұйрықтың бауырынан алынған РНҚ бір апта бойы суда сақталғаннан кейін негізінен бұзылды, ал егеуқұйрықтың көкбауырынан алынған РНҚ 3 жыл бойы суда сақталғаннан кейін тұрақты болып қалды.Сонымен қатар, ұзындығы 4 кб-тан асатын транскрипттер шағын транскрипттерге қарағанда іздік RNase арқылы деградацияға сезімтал.Сақталған РНҚ үлгілерінің тұрақтылығын арттыру үшін РНҚ-ны ионсыздандырылған формамидте ерітіп, -70°C температурада сақтауға болады.РНҚ-ны сақтау үшін қолданылатын формамид РНҚ-ны ыдырататын қалдықтардан таза болуы керек.Ұйқы безінің РНҚ-сы формамидте кем дегенде бір жыл сақталуы мүмкін.РНҚ-ны қолдануға дайындық кезінде РНҚ-ны тұндыру үшін келесі әдісті қолдануға болады: 0,2М және этанолдың 4 есе көлеміне NaCl қосып, бөлме температурасында 3-5 минутқа қойып, 10000×г 5 минут бойы центрифугалайды.

2. RNaseH-белсенді емес (RNaseH-) кері транскриптазасын пайдаланыңыз:

КДНҚ синтезінің ұзақтығы мен шығымдылығын арттыру үшін кері транскрипция реакцияларына RNase ингибиторлары жиі қосылады.RNase ингибиторларын буфер мен қалпына келтіретін агент (мысалы, DTT) қатысуымен бірінші тізбекті синтез реакциясы кезінде қосу керек, себебі cDNA синтезіне дейінгі процесс ингибиторды денатурациялайды, осылайша РНҚ-ны ыдыратуы мүмкін байланыстырылған РНҚ-ны босатады.Протеин RNase тежегіштері тек RNAse A, B, C арқылы РНҚ-ның ыдырауын болдырмайды және теріге RNase кедергісін жасамайды, сондықтан осы ингибиторларды пайдаланғанына қарамастан, саусақтарыңыздан RNase енгізуден сақ болыңыз.

Кері транскриптаза РНҚ-ның кДНҚ-ға айналуын катализдейді.M-MLV және AMV екеуі де өздерінің полимеразалық белсенділігіне қосымша эндогендік RNaseH белсенділігіне ие.RNaseH белсенділігі мен полимераза белсенділігі РНҚ үлгісі мен ДНҚ праймері немесе кДНҚ ұзартқыш тізбегі арасында түзілген гибридті тізбек үшін бір-бірімен бәсекелеседі және РНҚ:ДНҚ кешеніндегі РНҚ тізбегін ыдыратады.RNaseH белсенділігімен ыдыраған РНҚ үлгісі енді кДНҚ синтезі үшін тиімді субстрат ретінде қызмет ете алмайды, бұл кДНҚ синтезінің шығымы мен ұзақтығын азайтады.Сондықтан кері транскриптазаның RNaseH белсенділігін жою немесе айтарлықтай төмендету пайдалы болар еді.

SuperScript Ⅱ кері транскриптаза, RNaseH- MMLV кері транскриптаза және термоскрипт кері транскриптаза, RNaseH- AMV, MMLV және AMV-ге қарағанда көбірек және толық ұзындықтағы cDNA ала алады.RT-ПТР сезімталдығына cDNA синтезінің мөлшері әсер етеді.ThermoScript AMV-ге қарағанда әлдеқайда сезімтал.RT-ПТР өнімдерінің көлемі кері транскриптазаның кДНҚ синтездеу қабілетімен шектеледі, әсіресе үлкенірек кДНҚ клондау кезінде.MMLV-мен салыстырғанда SuperScripⅡ ұзақ RT-ПТР өнімдерінің шығымдылығын айтарлықтай арттырды.RNaseH-кері транскриптаза да термотұрақтылықты жоғарылатты, сондықтан реакцияны қалыпты 37-42°C-тан жоғары температурада жүргізуге болады.Ұсынылған синтез шарттарында олиго(dT) праймерін және [α-P]dCTP 10 μCi пайдаланыңыз.Бірінші тізбектің жалпы шығымдылығы TCA преципитация әдісімен есептелді.Толық ұзындықтағы cDNA өлшемі бойынша сұрыпталған жолақтарды пайдаланып талданған және сілтілі агарозды гельде есептелген.

3. Кері транскрипция үшін инкубациялық температураны көтеріңіз:

Жоғары инкубациялық температура РНҚ қайталама құрылымын ашуға көмектеседі, реакция шығымдылығын арттырады.РНҚ үлгілерінің көпшілігі үшін РНҚ мен праймерлерді буферсіз немесе тұзсыз 65°C инкубациялау, содан кейін мұзда жылдам салқындату екінші реттік құрылымдардың көпшілігін жояды және праймерлердің байланысуына мүмкіндік береді.Дегенмен, кейбір шаблондарда жылу денатурациясынан кейін де қайталама құрылымдар бар.Бұл қиын үлгілердің күшейтілуін күшейтуді жақсарту үшін ThermoScript кері транскриптазаны қолдану және кері транскрипция реакциясын жоғарырақ температурада орналастыру арқылы орындауға болады.Жоғары инкубациялық температуралар, әсіресе, cDNA синтезі үшін гендік спецификалық праймерлер (GSP) пайдаланылғанда, спецификалықты арттыруы мүмкін (3-тарауды қараңыз).Егер GSP пайдаланылса, праймерлердің Tm күтілетін инкубация температурасымен бірдей екеніне көз жеткізіңіз.Олиго(dT) және кездейсоқ праймерлерді 60°C жоғары температурада қолданбаңыз.Кездейсоқ праймерлер 60°C-қа дейін көтерілмес бұрын 25°C температурада 10 минут бойы инкубациялауды қажет етеді.Жоғары кері транскрипция температурасын қолданумен қатар, спецификалықты РНҚ/праймер қоспасын 65°C денатурация температурасынан кері транскрипцияның инкубация температурасына тікелей тасымалдау және алдын ала жылытылған 2× реакция қоспасын қосу арқылы да жақсартуға болады (cDNA ыстық-бастау синтезі).Бұл тәсіл төмен температурада пайда болатын молекулааралық негіздердің жұптасуына жол бермеуге көмектеседі.RT-ПТР үшін қажетті бірнеше температураны ауыстыруды термиялық циклдерді қолдану арқылы жеңілдетуге болады.

Tth термотұрақты полимераза Mg2+ қатысуымен ДНҚ-полимераза, ал Mn2+ қатысуымен РНҚ-полимераза қызметін атқарады.Оны максималды 65°C температурада жылы ұстауға болады.Дегенмен, ПТР кезінде Mn2+ болуы сенімділікті төмендетеді, бұл Tth полимеразаны кДНҚ клондау сияқты жоғары дәлдіктегі күшейту үшін жарамсыз етеді.Сонымен қатар, Tth кері транскрипция тиімділігі төмен, бұл сезімталдықты төмендетеді және кері транскрипция мен ПТР бір ферментпен орындалуы мүмкін болғандықтан, кері транскрипциясы жоқ бақылау реакциялары кДНҚ күшейту өнімдерін ластаушы геномдық ДНҚ-мен салыстыру үшін пайдаланыла алмайды.Күшейткіш өнімдер бөлінді.

4. Кері транскрипцияға ықпал ететін қоспалар:

Бірінші тізбекті синтездеу реакциясына глицерин мен DMSO қосатын қоспалар қосылады, олар нуклеин қышқылының қос тізбекті тұрақтылығын төмендетеді және РНҚ-ның қайталама құрылымын ажыратады.SuperScript II немесе MMLV белсенділігіне әсер етпестен 20% дейін глицерин немесе 10% DMSO қосуға болады.AMV сонымен қатар белсенділігін жоғалтпай 20% глицеринге шыдай алады.SuperScriptⅡ кері транскрипция реакциясында RT-PCR сезімталдығын барынша арттыру үшін 10% глицерин қосуға және 45°C температурада инкубациялауға болады.Егер кері транскрипция реакциясының өнімінің 1/10 бөлігі ПТР-ға қосылса, онда күшейту реакциясындағы глицерин концентрациясы 0,4% құрайды, бұл ПТР-ді тежеуге жеткіліксіз.

5. RNaseH емдеуі:

ПТР алдында кДНҚ синтез реакцияларын RNaseH көмегімен өңдеу сезімталдықты арттыруы мүмкін.Кейбір үлгілер үшін cDNA синтез реакциясындағы РНҚ күшейту өнімдерінің байланысуын болдырмайды деп есептеледі, бұл жағдайда RNaseH өңдеу сезімталдықты арттыруы мүмкін.Әдетте, RNaseH өңдеуі аз көшірме туберозды скероз II сияқты ұзағырақ толық ұзындықты cDNA мақсатты үлгілерін күшейту кезінде қажет.Бұл қиын үлгі үшін RNaseH өңдеу SuperScript II немесе AMV-синтезделген cDNA арқылы жасалған сигналды күшейтті.RT-ПТР реакцияларының көпшілігі үшін RNaseH өңдеу міндетті емес, өйткені 95°C температурадағы ПТР денатурация қадамы жалпы РНҚ: ДНҚ кешеніндегі РНҚ-ны гидролиздейді.

6. Шағын РНҚ анықтау әдісін жетілдіру:

RT-ПТР әсіресе аз мөлшерде РНҚ қол жетімді болған кезде өте қиын.РНҚ оқшаулау кезінде тасымалдаушы ретінде қосылған гликоген шағын үлгілердің шығымдылығын арттыруға көмектеседі.РНазсыз гликогенді Тризолды қосумен бір мезгілде қосуға болады.Гликоген суда ериді және одан кейінгі жауын-шашынға көмектесу үшін РНҚ-мен сулы фазада сақталуы мүмкін.50 мг тін немесе 106 өсірілген жасушадан аз үлгілер үшін RNase жоқ гликогеннің ұсынылатын концентрациясы 250 мкг/мл құрайды.

SuperScript II көмегімен кері транскрипция реакциясына ацетилденген BSA қосу сезімталдықты арттыруы мүмкін, ал РНҚ-ның аз мөлшері үшін SuperScript II мөлшерін азайту және RNaseOut нуклеаза ингибиторының 40 бірлігін қосу анықтау деңгейін жоғарылатуы мүмкін.Егер гликоген РНҚ оқшаулау процесінде пайдаланылса, кері транскрипция реакциясы үшін SuperScript II пайдаланған кезде BSA немесе RNase ингибиторын қосу ұсынылады.

二、RT-ПТР ерекшелігін арттыру

1. CND асинтезі:

Бірінші тізбекті кДНҚ синтезін үш түрлі әдіс арқылы бастауға болады, олардың салыстырмалы ерекшелігі синтезделген кДНҚ мөлшері мен түріне әсер етеді.

Кездейсоқ праймер әдісі үш әдістің ең аз ерекшелігі болды.Праймерлер транскрипттің барлық жерінде бірнеше жерде жасытады, қысқа, ішінара ұзындықты cDNA-ларды жасайды.Бұл әдіс 5′ соңғы реттілігін алу үшін және қайталама құрылым аймақтары бар немесе кері транскриптазамен репликацияланбайтын терминация учаскелері бар РНҚ үлгілерінен кДНҚ алу үшін жиі қолданылады.Ең ұзын кДНҚ алу үшін әрбір РНҚ үлгісіндегі праймерлердің РНҚ-ға қатынасын эмпирикалық жолмен анықтау қажет.Кездейсоқ праймерлердің бастапқы концентрациясы 20 мкл реакцияға 50-ден 250 нг дейін ауытқиды.Кездейсоқ праймерлер көмегімен жалпы РНҚ-дан синтезделген кДНҚ негізінен рибосомалық РНҚ болғандықтан, әдетте үлгі ретінде поли(А)+РНҚ таңдалады.

Oligo(dT) праймерлері кездейсоқ праймерлерге қарағанда ерекше.Ол эукариоттық мРНҚ-лардың көпшілігінің 3′ ұшында орналасқан поли(А) құйрығына гибридтенеді.Поли(А)+ РНҚ жалпы РНҚ-ның шамамен 1% - 2% құрайтындықтан, cDNA мөлшері мен күрделілігі кездейсоқ праймерлерге қарағанда әлдеқайда аз.Олиго(dT) өзінің жоғары ерекшелігіне байланысты, әдетте, РНҚ-ның праймерлерге қатынасын оңтайландыруды және поли(А)+ таңдауды қажет етпейді.20 мкл реакция жүйесіне 0,5 мкг олиго(дТ) қолдану ұсынылады.oligo(dT)12-18 көптеген RT-ПТР үшін қолайлы.ThermoScript RT-PCR жүйесі жоғары инкубациялық температуралар үшін жақсы термиялық тұрақтылыққа байланысты олиго(dT)20 ұсынады.

Гене спецификалық праймерлер (GSP) кері транскрипция сатысы үшін ең ерекше праймерлер болып табылады.GSP – кездейсоқ праймерлер немесе барлық РНҚ-ға қосылатын олиго(dT) сияқты емес, РНҚ мақсатты тізбегіне арнайы гибридтене алатын антисенс олигонуклеотид.ПТР праймерлерін жобалау үшін қолданылатын бірдей ережелер кері транскрипция реакцияларында GSP дизайнына қолданылады.GSP мРНҚ-ның 3′-ең шетіне дейін күйдіретін күшейту праймерімен бірдей реттілік болуы мүмкін немесе GSP кері күшейту праймерінің төменгі ағынын күйдіруге арналған.Кейбір күшейтілген субъектілер үшін сәтті RT-ПТР үшін бірнеше антисенсті праймер құрастырылуы керек, себебі мақсатты РНҚ-ның қайталама құрылымы праймердің байланысуына кедергі келтіруі мүмкін.20 мкл бірінші тізбекті синтездеу реакциясында 1 пмоль антисенс GSP қолдану ұсынылады.

2. Кері транскрипция үшін инкубациялық температураны көтеріңіз:

GSP ерекшелігінің толық артықшылығын толық пайдалану үшін жоғары термотұрақтылығы бар кері транскриптазаны пайдалану керек.Термотұрақты кері транскриптазаларды реакцияның қатаңдығын арттыру үшін жоғары температурада инкубациялауға болады.Мысалы, егер GSP 55°C температурада күйдірілсе, AMV немесе M-MLV кері транскрипция үшін 37°C төмен қатаңдықта пайдаланылса, GSP ерекшелігі толық пайдаланылмайды.Дегенмен, SuperScript II және ThermoScript 50°C немесе одан жоғары температурада әрекет ете алады, бұл төмен температурада пайда болатын арнайы емес өнімдерді жояды.Максималды ерекшелік үшін РНҚ/праймер қоспасын 65°C денатурация температурасынан кері транскрипцияның инкубация температурасына тікелей ауыстыруға және алдын ала қыздырылған 2× реакция қоспасына қосуға болады (cDNA синтезі ыстық басталуы).Бұл төмен температурада молекулааралық негіздердің жұптасуына жол бермеуге көмектеседі.RT-ПТР үшін қажетті бірнеше температуралық ауысуларды термиялық циклдерді қолдану арқылы жеңілдетуге болады.

3. Геномдық ДНҚ ластануын азайтады:

RT-ПТР кезінде кездесетін ықтимал қиындық РНҚ-дағы геномдық ДНҚ-ның ластануы болып табылады.Тризол реагенті сияқты жақсы РНҚ оқшаулау әдісін пайдалану РНҚ препаратын ластайтын геномдық ДНҚ мөлшерін азайтады.Геномдық ДНҚ-дан алынған өнімдерді болдырмау үшін кері транскрипциядан бұрын ластаушы ДНҚ-ны жою үшін РНҚ-ны күшейту деңгейіндегі DNase I көмегімен өңдеуге болады.DNase I қорытуы үлгілерді 2,0 мМ ЭДТА-да 65°C температурада 10 минут инкубациялау арқылы аяқталды.ЭДТА жоғары температурада магний ионына тәуелді РНҚ гидролизіне жол бермей, магний иондарын хелаттай алады.

Күшейтілген кДНҚ-ны ластаушы геномдық ДНҚ күшейту өнімдерінен бөлу үшін праймерлердің әрқайсысы экзондарды бөлу үшін жасыту үшін жобалануы мүмкін.cDNA-дан алынған ПТР өнімдері ластанған геномдық ДНҚ-дан алынғандарға қарағанда қысқа болады.Бұдан басқа, берілген фрагменттің геномдық ДНҚ немесе кДНҚ-дан алынғанын анықтау үшін әрбір РНҚ үлгісінде кері транскрипциясы жоқ бақылау эксперименті жүргізілді.Кері транскрипциясыз алынған ПТР өнімі геномнан алынған.