Зертханада жаңа болғандықтан, конверсия жылдамдығы төмен өсімдіктер шоғырынан оң өсімдіктерді іріктеу жақсы жұмыс емес.Біріншіден, көптеген үлгілерден ДНҚ бір-бірден алынуы керек, содан кейін бөтен гендер ПТР арқылы анықталады.Дегенмен, нәтижелер жиі бос орындар және анда-санда бірнеше элементі бар жолақтар болып табылады, бірақ өткізіп алған анықтаулар немесе жалған анықтаулар бар-жоғын анықтау мүмкін емес..Мұндай эксперименттік процесс пен нәтижелерге тап болу өте дәрменсіз бе?Уайымдамаңыз, аға сізге трансгенді позитивті өсімдіктерді оңай және дәл анықтауды үйретеді.

1-қадам

Дизайн анықтау праймерлері

Тексерілетін үлгіге сәйкес анықталатын эндогендік генді және экзогендік генді анықтаңыз және праймер дизайны үшін гендегі репрезентативті 100-500bp реттілігін таңдаңыз.Жақсы праймерлер анықтау нәтижелерінің дәлдігін қамтамасыз ете алады және анықтау уақытын қысқарта алады (жиі қолданылатын анықтау праймерлері үшін қосымшаны қараңыз).

Ескерту: Жаңадан әзірленген праймерлер реакция жағдайларын оңтайландыруы және ауқымды анықтау алдында анықтаудың дәлдігін, дәлдігін және анықтау шегін тексеруі керек.

2-қадам

Эксперименттік хаттаманы құрастыру

Оң бақылау: ПТР реакция жүйесі мен шарттары қалыпты екенін анықтау үшін үлгі ретінде мақсатты фрагменті бар тазартылған ДНҚ пайдаланыңыз.

Теріс/бос бақылау: ПТР жүйесінде ластану көзі бар-жоғын анықтау үшін үлгі ретінде мақсатты фрагментті қамтымайтын ДНҚ үлгісін немесе ddH2O пайдаланыңыз.

Ішкі анықтамалық бақылау: үлгіні ПТР арқылы анықтау мүмкіндігін бағалау үшін сыналатын үлгінің эндогендік генінің праймер/зонд комбинациясын пайдаланыңыз.

Ескерту:

Эксперимент нәтижелерінің дұрыстығын бағалау үшін әрбір сынақ үшін оң, теріс/бос бақылаулар және ішкі бақылау бақылаулары орнатылуы керек.

Экспериментке дайындық

Қолданар алдында ерітіндінің біркелкі араласқанына көз жеткізіңіз.Егер тұнба табылса, оны қолданар алдында нұсқауларға сәйкес ерітіп, араластыру керек.2×ПТР қоспасын тамшуырмен тамызып, иондардың біркелкі таралуын болдырмау үшін қолданар алдында микропипеткамен қайта-қайта араластыру қажет.

Ескерту:

Нұсқаулықты алыңыз және оны мұқият оқып шығыңыз және нұсқаулықтың талаптарына қатаң сәйкес эксперимент алдында дайындық жасаңыз.

4-қадам

ПТР реакция жүйесін дайындаңыз

Эксперименттік хаттамаға сәйкес праймерлерді, H2O және 2×ПТР қоспасын біркелкі араластырыңыз, центрифугалаңыз және оларды әрбір реакция түтігіне таратыңыз.

Ескерту:

Кең ауқымды немесе ұзақ мерзімді тестілеу үшін құрамында UNG ферменті бар ПТР реакция жүйесін пайдалану ұсынылады, ол ПТР өнімдерімен туындаған аэрозольді ластануды тиімді болдырмайды.

5-қадам

Реакция үлгісін қосыңыз

Тікелей ПТР технологиясын қолдана отырып, нуклеин қышқылын тазартудың жалықтыратын процесінің қажеті жоқ, үлгі үлгісін 10 минут ішінде дайындауға және сәйкес ПТР реакция жүйесін қосуға болады.

Ескерту:

Бөлу әдісі жақсырақ анықтау эффектісіне ие және алынған өнімді бірнеше анықтау реакциялары үшін пайдалануға болады.

5.1: Жапырақтардың тікелей кеңеюі

Нұсқаулықтағы суреттің өлшеміне сәйкес диаметрі 2-3мм жапырақ тінін кесіп, ПТР реакция жүйесіне орналастырыңыз.

Ескертпе: Жапырақ фрагменттері ПТР реакциясы ерітіндісіне толығымен батырылғанына көз жеткізіңіз және артық жапырақ тінін қоспаңыз.

5.2: Жапырақтарды бөлу әдісі

Жапырақ ұлпасын диаметрі 5-7мм кесіп алып, центрифугалық түтікке салыңыз.Егер сіз піскен жапырақтарды таңдасаңыз, жапырақтың негізгі тамырының тіндерін пайдаланбаңыз.Лизаттың жапырақ тінін толығымен батыруын қамтамасыз ету үшін 50ul Buffer P1 лизатын пипеткамен центрифуга түтігіне құйыңыз, оны термиялық циклерге немесе металл ваннаға салыңыз және 95°C температурада 5-10 минут ішінде лизис жасаңыз.

50ul Buffer P2 бейтараптандыру ерітіндісін қосып, жақсылап араластырыңыз.Алынған лизатты үлгі ретінде пайдалануға және ПТР реакция жүйесіне қосуға болады.

Ескертпе: Үлгі мөлшері ПТР жүйесінің 5-10%-ы арасында және 20%-дан аспауы керек (мысалы, 20 мкл ПТР жүйесінде 1-2 мкл лизис ерітіндісін қосыңыз, 4 мкл артық емес).

6-қадам

ПТР реакциясы

ПТР реакциясы түтігін центрифугалаудан кейін күшейту үшін ПТР құралына салынады.

Ескерту:

Реакция күшейту үшін тазартылмаған шаблонды пайдаланады, сондықтан күшейту циклдерінің саны тазартылған ДНҚ үлгісін пайдаланғанға қарағанда 5-10 циклге көп.

7-қадам

Электрофорезді анықтау және нәтижені талдау

M: 100bp ДНҚ сатысы

1\4: Тазартылған ДНҚ әдісі

2\5: Тікелей ПТР әдісі

3\6: бос басқару

QC:

Экспериментте орнатылған әртүрлі бақылаулардың сынақ нәтижелері келесі шарттарға сәйкес болуы керек.Әйтпесе, мәселенің себебін талдап, ақау жойылғаннан кейін сынақты қайтадан орындау керек.

Кесте 1. Әртүрлі бақылау топтарының қалыпты сынақ нәтижелері

*Плазмидті оң бақылау ретінде пайдаланған кезде эндогендік гендік сынақ нәтижесі теріс болуы мүмкін

Қорытынды шешім:

A. Үлгінің эндогендік генінің сынақ нәтижесі теріс, бұл үлгіден қарапайым ПТР анықтауға жарамды ДНҚ-ны алу мүмкін еместігін немесе алынған ДНҚ құрамында ПТР реакциясының тежегіштері бар екенін және ДНҚ-ны қайтадан экстракциялау керектігін көрсетеді.

B. Үлгінің эндогендік генінің сынақ нәтижесі оң, ал экзогендік геннің сынақ нәтижесі теріс, бұл үлгіден қарапайым ПТР анықтауға жарамды ДНҚ алынғанын көрсетеді және үлгіде XXX гені анықталмаған деп бағалауға болады.

C. Үлгінің эндогендік генінің сынақ нәтижесі оң, ал экзогендік геннің сынау нәтижесі оң, бұл үлгіден қарапайым ПТР анықтауға жарамды ДНҚ алынғанын және үлгі ДНҚ құрамында XXX гені бар екенін көрсетеді.Растау эксперименттерін одан әрі жүргізуге болады.

8-қадам

Дизайн анықтау праймерлері

Тәжірибеден кейін қоршаған ортаның ластануын болдырмау үшін тәжірибе алаңын сүрту үшін 2% натрий гипохлориті ерітіндісін және 70% этанол ерітіндісін пайдаланыңыз.