RT-qPCR қарапайым ПТР технологиясынан жасалған.Ол дәстүрлі ПТР реакция жүйесіне флуоресцентті химиялық заттарды (флуоресцентті бояғыштар немесе флуоресцентті зондтар) қосады және олардың әртүрлі люминесцентті механизмдеріне сәйкес нақты уақытта ПТР жасыту және ұзарту процесін анықтайды.Ортадағы флуоресцентті сигналдың өзгерістері ПТР әрбір циклінде өнімнің өзгеру мөлшерін есептеу үшін қолданылады.Қазіргі уақытта ең көп таралған әдістер - флуоресцентті бояу әдісі және зонд әдісі.

Флуоресцентті бояу әдісі:
Кейбір флуоресцентті бояғыштар, мысалы, SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO және т.б., өздігінен жарық шығармайды, бірақ dsDNA-ның кіші ойығымен байланысқаннан кейін флуоресценция шығарады.Сондықтан ПТР реакциясының басында құрылғы флуоресцентті сигналды анықтай алмайды.Реакция жасыту-кеңейту (екі сатылы әдіс) немесе ұзарту сатысына (үш сатылы әдіс) өткенде, осы уақытта қос тізбектер ашылады және жаңа ДНҚ полимераза Жіп синтезі кезінде флуоресцентті молекулалар dsDNA кіші ойығында біріктіріліп, флуоресценция шығарады.ПТР циклдерінің саны артқан сайын, көбірек бояғыштар dsDNA-мен біріктіріледі және флуоресцентті сигнал да үздіксіз күшейтіледі.Мысал ретінде SYBR Green Ⅰ алайық.
Зонд әдісі:
Такман зонды ең жиі қолданылатын гидролиздік зонд болып табылады.Зондтың 5′ ұшында флуоресцентті топ бар, әдетте FAM.Зондтың өзі мақсатты генді толықтыратын тізбек болып табылады.Флуорофордың 3′ ұшында флуоресцентті сөндіру тобы бар.Флуоресцентті резонанстық энергияның берілу принципіне сәйкес (Förster резонансты энергияның ауысуы, FRET), репортер флуоресценттік топ (донорлық флуоресцентті молекула) және сөндіруші флуоресцентті топ (акцепторлы флуоресцентті молекула) қозу спектрі қабаттасып, қашықтығы өте жақын (7-10 нм флуоресцентті флуоресценттік молекула) болғанда, акцепторлы молекула, ал автофлуоресценция әлсіреген.Сондықтан, ПТР реакциясының басында зонд жүйеде бос және бүтін болғанда, репортер флуоресцентті топ флуоресценцияны шығармайды.Жасыту кезінде праймер мен зонд үлгіге байланады.Кеңейту кезеңінде полимераза үздіксіз жаңа тізбектерді синтездейді.ДНҚ-полимераза 5′-3′ экзонуклеаза белсенділігіне ие.Зондқа жеткенде, ДНҚ полимераза үлгідегі зондты гидролиздейді, репортер флуоресценттік тобын сөндіруші флуоресценттік топтан бөліп, флуоресцентті сигналды шығарады.Зонд пен шаблон арасында бір-бірлік байланыс болғандықтан, сынақтың дәлдігі мен сезімталдығы бойынша зонд әдісі бояу әдісінен жоғары.

1-сурет qRT-ПТР принципі

Праймер дизайны
Принциптері:

Праймерлер нуклеин қышқылы қатарының сақталған аймағында жобалануы және ерекшелігі болуы керек.

Ең дұрысы cDNA тізбегін пайдалану және мРНҚ тізбегі де қолайлы.Олай болмаса, ДНҚ тізбегінің cds аймағының дизайнын табыңыз.
Флуоресцентті сандық өнімнің ұзындығы 80-150 бит, ең ұзыны 300 бит, праймер ұзындығы әдетте 17-25 негіз арасында, ал жоғары және төменгі ағынды праймерлердің арасындағы айырмашылық тым үлкен болмауы керек.

G+C мазмұны 40% және 60% арасында, ал 45-55% ең жақсысы.
ТМ мәні 58-62 градус аралығында.
Праймер димерлері мен өздігінен димерлерден аулақ болуға тырысыңыз, (қатарынан қосымша негіздердің 4 жұптан артық пайда болмауы) шаш қыстырғыш құрылымы, егер сөзсіз болса, ΔG<4,5кДж/моль* жасаңыз. Кері транскрипция кезінде gDNA жойылғанына көз жеткізе алмасаңыз, интронның праймерлерін жобалаған дұрыс. A/G үздіксіз құрылымды (2-3) праймерлер және емес
спецификалық Біртекті емес күшейтілген тізбектің гомологиясы жақсырақ 70%-дан аз немесе 8 қосымша негіз гомологиясы бар.
Дерекқор:
CottonFGD кілт сөздер бойынша іздеу
Праймер дизайны:
IDT-qPCR праймер дизайны

Fig2 IDT онлайн праймерді жобалау құралының беті

Сурет 3 нәтиже бетін көрсету
lncRNA праймерлерінің дизайны:
lncRNA:мРНҚ сияқты қадамдар.
миРНҚ:Бағаналы цикл әдісінің принципі: Барлық miRNA-лар шамамен 23 nt қысқа тізбектер болғандықтан, тікелей ПТР анықтау мүмкін емес, сондықтан діңгек-цикл реттілігі құралы пайдаланылады.Бағаналы-ілмек тізбегі - бұл шамамен 50 нт болатын бір тізбекті ДНҚ, ол өздігінен шаш қыстырғыш құрылымын құра алады.3 'Соңы миРНҚ ішінара фрагментіне қосымша реттілік ретінде жобалануы мүмкін, содан кейін мақсатты miRNA кері транскрипция кезінде діңгек-цикл тізбегіне қосылуы мүмкін және жалпы ұзындығы 70bp жетуі мүмкін, бұл qPCR арқылы анықталған күшейтілген өнімнің ұзындығына сәйкес келеді.Қалдық миРНҚ праймер дизайны.
Күшейтуге тән анықтау:
Желідегі жарылыс дерекқоры: реттілік ұқсастығы бойынша CottonFGD жарылыс
Жергілікті жарылыс: Жергілікті жарылыс жасау үшін Blast+ пайдалануды қараңыз, Linux және macos жергілікті дерекқорды тікелей құра алады, win10 жүйесін де ubuntu bash орнатқаннан кейін жасауға болады.Жергілікті жарылыс деректер базасын және жергілікті жарылыс жасау;win10 жүйесінде ubuntu bash ашыңыз.
Ескерту: Таулы мақта мен теңіз аралының мақтасы тетраплоидты дақылдар болып табылады, сондықтан жарылыс нәтижесі жиі екі немесе одан да көп сіріңке болады.Бұрын жарылыс жасау үшін NAU CD дискілерін дерекқор ретінде пайдалану тек бірнеше SNP айырмашылықтары бар екі гомологиялық генді табуы мүмкін.Әдетте, екі гомологиялық генді праймер дизайнымен бөлуге болмайды, сондықтан олар бірдей деп есептеледі.Егер айқын индель бар болса, праймер әдетте инделде жобаланады, бірақ бұл праймердің қайталама құрылымына әкелуі мүмкін Бос энергия жоғарылайды, күшейту тиімділігінің төмендеуіне әкеледі, бірақ бұл сөзсіз.

Бастапқы екінші құрылымды анықтау:
Қадамдар:олиго 7 ашу → енгізу үлгісі реттілігі → ішкі терезені жабу → сақтау → үлгідегі праймерді табу, праймер ұзындығын орнату үшін ctrl+D пернелерін басыңыз → өзін-өзі димеризациялау корпусы, гетеродимер, шаш қыстырғышы, сәйкессіздік және т.б. сияқты әртүрлі қосалқы құрылымдарды талдаңыз. 4-суреттегі соңғы екі сурет праймерлердің сынақ нәтижелері болып табылады.Алдыңғы праймердің нәтижесі жақсы, айқын димер мен шаш қыстырғыш құрылымы жоқ, үздіксіз толықтырушы негіздер жоқ және бос энергияның абсолютті мәні 4,5-тен аз, ал артқы праймер үздіксіз көрсетеді 6 негіз қосымша, ал бос энергия 8,8;сонымен қатар, 3′ ұшында неғұрлым күрделі димер пайда болады және 4 дәйекті негіздердің димері пайда болады.Бос энергия жоғары болмаса да, 3′ димер Chl күшейту ерекшелігіне және күшейту тиімділігіне елеулі әсер етуі мүмкін.Бұдан басқа, шаш қыстырғыштарын, гетеродимерлерді және сәйкессіздіктерді тексеру қажет.

Fig3 oligo7 анықтау нәтижелері
Күшейтудің тиімділігін анықтау:
ПТР реакциясының күшейту тиімділігі ПТР нәтижелеріне айтарлықтай әсер етеді.Сондай-ақ qRT-ПТР-да күшейту тиімділігі сандық нәтижелер үшін ерекше маңызды.Реакция буферіндегі басқа заттарды, машиналарды және хаттамаларды алып тастаңыз.Праймерлердің сапасы qRT-ПТР күшейту тиімділігіне де үлкен әсер етеді.Нәтижелердің дәлдігін қамтамасыз ету үшін салыстырмалы флуоресценцияның сандық көрсеткіші де, абсолютті флуоресценция сандық көрсеткіштері де праймерлердің күшейту тиімділігін анықтауы керек.Тиімді qRT-ПТР күшейту тиімділігі 85% және 115% арасында екені белгілі.Екі әдіс бар:
1. Стандартты қисық әдіс:
а.cDNA араластырыңыз
б.Градиент сұйылту
c.qPCR
г.Күшейтудің тиімділігін есептеу үшін сызықтық регрессия теңдеуі
2. LinRegPCR
LinRegPCR – SYBR Green немесе ұқсас химия негізіндегі сандық ПТР (qPCR) деректері деп те аталатын нақты уақыттағы RT-PCR деректерін талдауға арналған бағдарлама.Бағдарлама базалық емес түзетілген деректерді пайдаланады, әрбір үлгі бойынша бастапқы түзетуді жеке орындайды, сызықтық терезені анықтайды, содан кейін ПТР деректер жинағы арқылы түзу сызықты сәйкестендіру үшін сызықтық регрессия талдауын пайдаланады.Осы сызықтың еңісінен әрбір жеке үлгінің ПТР тиімділігі есептеледі.Бір ампликондағы ПТР орташа тиімділігі және үлгідегі Ct мәні ерікті флуоресценция бірліктерімен көрсетілген үлгідегі бастапқы концентрацияны есептеу үшін пайдаланылады.Деректерді енгізу және шығару Excel электрондық кестесі арқылы жүзеге асырылады.Тек үлгі
араластыру қажет, градиент жоқ
қадамдар қажет:(Мысал ретінде Bole CFX96 алыңыз, анық ABI бар машина емес)
эксперимент:бұл стандартты qPCR эксперименті.
qPCR деректер шығысы:LinRegPCR шығыс файлдарының екі пішінін тани алады: RDML немесе сандық күшейту нәтижесі.Шындығында, бұл машинаның цикл нөмірі мен флуоресценция сигналының нақты уақытта анықтау мәні және күшейту сызықтық сегмент тиімділігінің флуоресценцияның өзгеру мәнін талдау арқылы алынады.
Деректерді таңдау: Теориялық тұрғыдан RDML мәні пайдалануға жарамды болуы керек.Менің компьютерімнің проблемасы бағдарламалық жасақтаманың RDML-ді тани алмайтындығы болып табылады, сондықтан менде бастапқы деректер ретінде excel шығыс мәні бар.Алдымен деректердің өрескел скринингін орындау ұсынылады, мысалы, үлгілерді қосудың сәтсіздігі және т.б. Нүктелерді шығыс деректерінде жоюға болады (әрине, оларды жою мүмкін емес, LinRegPCR кейінгі кезеңде бұл нүктелерді елемейді)

Сурет5 qPCR деректерін экспорттау

Сурет 6 үміткер үлгілерді таңдау

Деректерді енгізу:Біліктілікті күшейту нәтижелерін ашыңыз.xls, → LinRegPCR ашыңыз → файл → excel бағдарламасынан оқыңыз → 7-суретте көрсетілгендей параметрлерді таңдаңыз → OK → негізгі сызықтарды анықтау түймесін басыңыз.

linRegPCR деректерін енгізудің сурет 7 қадамдары

Нәтиже:Қайталау болмаса, топтастыру қажет емес.Қайталану болса, топтауды үлгі топтастыруда өңдеуге болады, ал геннің аты идентификаторға енгізіледі, содан кейін сол ген автоматты түрде топтастырылады.Соңында, файлды басыңыз, excel экспорттаңыз және нәтижелерді қараңыз.Әрбір ұңғыманың күшейту тиімділігі және R2 нәтижелері көрсетіледі.Екіншіден, топтарға бөлсеңіз, түзетілген орташа күшейту тиімділігі көрсетіледі.Әрбір праймердің күшейту тиімділігі 85% және 115% аралығында екеніне көз жеткізіңіз.Егер ол тым үлкен немесе тым кішкентай болса, бұл праймердің күшейту тиімділігі нашар екенін білдіреді.

8-сурет Нәтиже және деректерді шығару

Эксперименттік процесс:
РНҚ сапасына қойылатын талаптар:
Тазалық:1.72,0 қалдық изотиоцианат болуы мүмкін екенін көрсетеді.Таза нуклеин қышқылы A260/A230 шамамен 2 болуы керек.Егер 230 нм-де күшті сіңіру болса, бұл фенат иондары сияқты органикалық қосылыстардың бар екенін көрсетеді.Сонымен қатар, оны 1,5% агарозды гель электрофорезі арқылы анықтауға болады.Маркерді көрсетіңіз, өйткені ssRNA денатурациясы жоқ және молекулалық салмақ логарифмінде сызықтық байланыс жоқ, ал молекулалық салмақты дұрыс көрсету мүмкін емес.Шоғырлану: Теориялықемес100 нг/ул-ден аз, егер концентрация тым төмен болса, тазалық әдетте төмен, биік емес

Сурет 9 РНҚ гелі

Сонымен қатар, егер үлгі қымбат болса және РНҚ концентрациясы жоғары болса, оны экстракциядан кейін аликвота және кері транскрипция үшін РНҚ-ны 100-300 нг/ул соңғы концентрациясына дейін сұйылту ұсынылады.жылыкері транскрипция процесі, мРНҚ транскрипцияланған кезде, кері транскрипция үшін полиА құйрықтарымен арнайы байланыса алатын олиго (dt) праймерлер пайдаланылады, ал lncRNA және circRNA жалпы РНҚ кері транскрипциясы үшін кездейсоқ гексамер (кездейсоқ 6 мер) праймерлерін miRNA үшін, миРНҚ-арнайы транскрипция үшін транскрипция-арнайы тракрипциялар үшін пайдаланылады.Қазір көптеген компаниялар арнайы қалдықтар жинағыштарын шығарды.Бағаналы цикл әдісі үшін қалдық әдісі ыңғайлы, жоғары өнімді және реагентті үнемдейді, бірақ бір отбасының миРНҚ-ларын ажырату әсері діңгек-ілмек әдісі сияқты жақсы болмауы керек.Әрбір кері транскрипция жинағында гендік спецификалық праймерлердің концентрациясына қойылатын талаптар бар.miRNA үшін пайдаланылатын ішкі сілтеме U6.Бағаналы контурдың инверсиясы процесінде U6 түтігін бөлек айналдыру керек, ал U6 алдыңғы және артқы праймерлерін тікелей қосу керек.circRNA және lncRNA екеуі де HKGs ішкі сілтеме ретінде пайдалана алады.жылыcDNA анықтау,
егер РНҚ-мен проблема болмаса, cDNA да жақсы болуы керек.Дегенмен, егер тәжірибенің жетілдірілуі көзделсе, gDNA-ны CD-ден ажырата алатын ішкі анықтамалық генді (Reference gen, RG) қолданған дұрыс.Жалпы, RG - үй шаруашылығын жүргізу гені., HKG) 10-суретте көрсетілгендей;Ол кезде мен соя сақтау ақуызын жасап жатырмын және ішкі анықтама ретінде құрамында интрондары бар актин7-ді қолдандым.Бұл праймердің гДНҚ-дағы күшейтілген фрагментінің өлшемі 452 бит, ал егер кДНҚ шаблон ретінде пайдаланылса, ол 142 бит болды.Содан кейін сынақ нәтижелері cDNA бөлігінің шынымен гДНҚ-мен ластанғанын анықтады, сонымен қатар кері транскрипция нәтижесімен ешқандай проблема жоқ екенін және оны ПТР үлгісі ретінде пайдалануға болатынын дәлелдеді.Агарозды гель электрофорезін тікелей кДНҚ-мен жүргізу пайдасыз және бұл диффузиялық жолақ, бұл сенімді емес.

10-сурет cDNA анықтау

qPCR шарттарын анықтаунегізінен tm мәнінің қадамында жиынтық хаттамасына сәйкес әдетте проблема жоқ.Кейбір праймерлер праймерді жобалау кезінде жақсы жобаланбаған болса, нәтижесінде tm мәні мен теориялық 60°C арасындағы үлкен айырмашылық болса, cDNA үлгілері араласқаннан кейін праймерлермен градиенттік ПТР жүргізіп, температураны TM мәні ретінде жолақтарсыз орнатудан аулақ болуға тырысыңыз.

Деректерді талдау

Кәдімгі салыстырмалы флуоресцентті сандық ПТР өңдеу әдісі негізінен 2-ге сәйкес-ΔΔCT.Мәліметтерді өңдеу үлгісі.

Қосымша тауарлар:

Нақты уақыттағы ПТР оңай^TM – Тақман

Нақты уақыттағы ПТР оңай^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (бірінші тізбекті cDNA синтезіне арналған негізгі премикс)

RT Easy II (qPCR үшін бірінші тізбекті cDNA синтезіне арналған негізгі премикс)