ПТР (полимеразды тізбекті реакция) – 30 жылдан астам тарихы бар in-vitro ДНҚ күшейту технологияларының бірі.

ПТР технологиясын 1983 жылы АҚШ-тың Цетус штатындағы Кэри Муллис пионер болып енгізді. Муллис 1985 жылы ПТР патентіне өтініш берді және сол жылы Ғылым туралы алғашқы ПТР академиялық мақаласын жариялады.Маллис 1993 жылы химия бойынша Нобель сыйлығының лауреаты атанды.

ПТР негізгі принциптері

ПТР мақсатты ДНҚ фрагменттерін миллионнан астам есе күшейте алады.Бұл принцип ДНҚ-полимераза катализінде, үлгі ретінде ДНҚ-ның аналық тізбегін және кеңейтудің бастапқы нүктесі ретінде арнайы праймерді пайдаланады.Ол денатурация, жасыту және ұзарту сияқты қадамдар арқылы in vitro репликацияланады.ДНҚ-ның аналық тізбек шаблонына комплементарлы аналық тізбектің ДНҚ процесі.

Стандартты ПТР процесі үш кезеңге бөлінеді:

1.Денатурация: ДНҚ қос тізбектерін бөлу үшін жоғары температураны пайдаланыңыз.ДНҚ қос тізбектері арасындағы сутектік байланыс жоғары температурада (93-98℃) үзіледі.

2.Жайлау: қос тізбекті ДНҚ бөлінгеннен кейін, праймер бір тізбекті ДНҚ-мен байланыса алатындай температураны төмендетіңіз.

3. Кеңейту: ДНҚ полимераза температура төмендеген кезде байланыстырылған праймерлерден ДНҚ жіптері бойымен комплементарлы тізбектерді синтездей бастайды.Кеңейту аяқталған кезде цикл аяқталады және ДНҚ фрагменттерінің саны екі есе артады

Осы үш қадамды 25-35 рет қайталаса, ДНҚ фрагменттерінің саны экспоненциалды түрде артады.

ПТР-ның тапқырлығы әртүрлі праймерлердің әртүрлі мақсатты гендер үшін жобалануы мүмкін, сондықтан мақсатты ген фрагменттерін қысқа уақыт ішінде күшейтуге болады.

Әзірге ПТР үш санатқа бөлуге болады, атап айтқанда қарапайым ПТР, флуоресцентті сандық ПТР және цифрлық ПТР.

Қарапайым ПТР бірінші буыны

Мақсатты генді күшейту үшін кәдімгі ПТР күшейту құралын пайдаланыңыз, содан кейін өнімді анықтау үшін агарозды гель электрофорезін пайдаланыңыз, тек сапалы талдау жасауға болады.

Бірінші буын ПТР негізгі кемшіліктері:

1.Спецификалық емес күшейтуге және жалған оң нәтижелерге бейім.

2.Анықтау ұзақ уақыт алады және операция ауыр.

3.Тек сапалы сынақтан өтуге болады

Екінші буын нақты уақыттағы ПТР

Нақты уақыттағы ПТР, сонымен қатар qPCR ретінде белгілі, реакция жүйесінің барысын көрсете алатын флуоресцентті зондтарды пайдаланады және флуоресцентті сигналдардың жинақталуы арқылы күшейтілген өнімдердің жинақталуын бақылайды және флуоресценция қисығы арқылы нәтижелерді бағалайды.Оны Cq мәні мен стандартты қисық көмегімен сандық анықтауға болады.

qPCR технологиясы жабық жүйеде жүзеге асырылатындықтан, ластану ықтималдығы төмендейді және сандық анықтау үшін флуоресценттік сигналды бақылауға болады, сондықтан ол клиникалық тәжірибеде ең кең таралған және ПТР-де басым технологияға айналды.

Нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР кезінде қолданылатын флуоресцентті заттарды мыналарға бөлуге болады: TaqMan флуоресцентті зонд, молекулалық маяктар және флуоресцентті бояу.

1) TaqMan флуоресцентті зонд:

ПТР күшейту кезінде жұп праймерді қосу кезінде арнайы флуоресцентті зонд қосылады.Зонд олигонуклеотид болып табылады және екі ұшы репортер флуоресценттік тобымен және сөндіруші флуоресценттік топпен таңбаланған.

Зонд бүтін болған кезде репортер тобы шығаратын флуоресцентті сигналды сөндіру тобы жұтады;ПТР күшейту кезінде Taq ферментінің 5′-3′ экзонуклеаза белсенділігі зондты ыдыратады және ыдыратады, бұл флуоресцентті топты ажыратады, осылайша флуоресцентті бақылау жүйесі флуоресценция сигналын қабылдай алады, яғни ДНҚ тізбегі күшейген сайын, тұмау немесе флюоресцентті мойынтұмсық пайда болады, сигнал ПТР өнімінің қалыптасуымен толығымен синхрондалады.

2) SYBR флуоресцентті бояу:

ПТР реакция жүйесінде SYBR флуоресцентті бояудың артық мөлшері қосылады.SYBR флуоресцентті бояу ДНҚ қос тізбегіне спецификалық емес түрде енгізілгеннен кейін ол флуоресцентті сигнал шығарады.Тізбекке қосылмаған SYBR бояғыш молекуласы флуоресцентті сигналды шығармайды, осылайша флуоресцентті сигналды қамтамасыз етеді ПТР өнімдерінің көбеюі ПТР өнімдерінің ұлғаюымен толығымен синхрондалады.SYBR тек қос тізбекті ДНҚ-мен байланысады, сондықтан балқу қисығын ПТР реакциясының спецификалық екенін анықтау үшін пайдалануға болады.

3) Молекулярлық маяк:

Бұл 5 және 3 ұштарында шамамен 8 негізден тұратын шаш қыстырғыш құрылымын құрайтын екі таңбалы олигонуклеотидті ілмекті зонд.Нуклеин қышқылдарының екі жағындағы тізбегі қосымша түрде жұптастырылған, бұл флуоресцентті топ пен сөндіру тобының тығыз болуына әкеледі.Жабыңыз, флуоресценция шығарылмайды.

ПТР өнімі жасалғаннан кейін, жасыту процесі кезінде молекулалық маяктың ортаңғы бөлігі белгілі бір ДНҚ тізбегімен жұптастырылады, ал флуоресцентті ген флуоресценция алу үшін сөндіруші геннен бөлінеді.

Екінші буындағы ПТР негізгі кемшіліктері:

Сезімталдық әлі де жоқ, ал аз көшірме үлгілерді анықтау дәл емес.

Фондық мәннің әсері бар және нәтиже кедергіге бейім.

Реакция жүйесінде ПТР ингибиторлары болған кезде анықтау нәтижелері кедергілерге сезімтал болады.

Үшінші буын цифрлық ПТР

Сандық ПТР (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) түпкілікті нүктені анықтау арқылы мақсатты тізбектің көшірме нөмірін есептейді және ішкі басқару элементтерін және стандартты қисықтарды пайдаланбай дәл абсолютті сандық анықтауды орындай алады.

Сандық ПТР соңғы нүктені анықтауды пайдаланады және Ct мәніне (цикл шегі) тәуелді емес, сондықтан цифрлық ПТР реакциясына күшейту тиімділігі аз әсер етеді, ал ПТР реакция ингибиторларына төзімділік жоғары дәлдікпен және қайталану мүмкіндігімен жақсарады.

Жоғары сезімталдық пен жоғары дәлдік сипаттамаларының арқасында оған ПТР реакция ингибиторлары оңай араласпайды және ол стандартты өнімдерсіз шынайы абсолютті сандық анықтауға қол жеткізе алады, бұл зерттеу мен қолданудың ыстық нүктесіне айналды.

Реакция бірлігінің әртүрлі формалары бойынша оны үш негізгі түрге бөлуге болады: микрофлюидтік, чиптік және тамшылық жүйелер.

1) Микрофлюидтік цифрлық ПТР, mdPCR:

Микрофлюидтік технология негізінде ДНҚ үлгісі бөлінеді.Микрофлюидтік технология үлгінің нано-жаңартуын немесе кішірек тамшылардың генерациясын жүзеге асыра алады, бірақ тамшыларға арнайы адсорбция әдісі қажет, содан кейін ПТР реакция жүйесімен біріктіріледі.mdPCR бірте-бірте ауыстырудың басқа әдістерімен қабылданды.

2) Тамшылар негізіндегі цифрлық ПТР, ddPCR:

Үлгіні тамшыларға өңдеу үшін майдағы су тамшысын жасау технологиясын пайдаланыңыз және құрамында нуклеин қышқылы молекулалары бар реакция жүйесін мыңдаған наноөлшемді тамшыларға бөліңіз, олардың әрқайсысында анықталатын нуклеин қышқылының мақсатты молекуласы жоқ немесе сыналатын нуклеин қышқылының мақсатты молекуласы бір немесе бірнеше нуклеин қышқылынан тұрады.

3) Чип негізіндегі цифрлық ПТР, cdPCR:

Кремний пластинкаларына немесе кварц әйнегіне көптеген микротүтіктер мен микроқуыстарды ойып түсіру және әртүрлі бақылау клапандары арқылы ерітінді ағынын бақылау және абсолютті сандық анықтауға қол жеткізу үшін үлгі сұйықтығын сандық ПТР реакциясы үшін реакция ұңғымаларына бірдей өлшемдегі нанометрлерге бөлу үшін интеграцияланған сұйықтық жолы технологиясын пайдаланыңыз.

Үшінші ұрпақтың ПТР негізгі кемшіліктері:

Құрал-жабдықтар мен реагенттер қымбат.

Үлгі сапасына қойылатын талаптар жоғары.Егер шаблон мөлшері микрожүйе шамасынан асып кетсе, сандық анықтау мүмкін болмайды, ал тым аз болса, сандық анықтау дәлдігі төмендейді.

Арнайы емес күшейту болған кезде жалған позитивтер де жасалуы мүмкін.