ПТР, бірнеше ПТР, In situ ПТР, Кері ПТР, RT-ПТР, qPCR（1）–ПТР

Біз әртүрлі ПТР тұжырымдамаларын, қадамдарын және бөлшектерін сұрыптаймыз

Ⅰ. ПТР

Полимеразды тізбекті реакция, ПТР деп аталады, бұл арнайы ДНҚ фрагменттерін үлкейту үшін қолданылатын молекулалық биологиялық технология.Оны in vitro арнайы ДНҚ репликациясы ретінде қарастыруға болады.ДНҚ-полимераза (ДНҚ полимераза I) 1955 жылдың өзінде-ақ ашылды, ал тәжірибелік мәні мен практикалық қасиеті бар E. Coli-нің Кленов фрагментін 1970 жылдардың басында доктор Х.Кленоу ашты, бірақ бұл фермент температураға шыдамайтындықтан, жоғары температура оны деградациялауы мүмкін, сондықтан ол полимеразаның жоғары температуралық реакциясына сәйкес келмейді.Қазіргі уақытта қолданылатын ферменттер (Taq полимераза деп аталады) 1976 жылы ыстық бұлақ бактериясы Thermus aquaticus-тен бөлініп алынды. Оның ерекшелігі - ол жоғары температураға төтеп бере алады және тамаша фермент болып табылады, бірақ ол 1980 жылдардан кейін кеңінен қолданыла бастады.ПТР бастапқы қарабайыр прототипінің бастапқы тұжырымдамасы генді жөндеу және көшіруге ұқсас, оны 1971 жылы доктор КЖелл Клеппе ұсынған. Ол геннің қарапайым және қысқа мерзімді алғашқы көшірмесін жариялады (ПТР алғашқы екі циклдік реакциясына ұқсас).Бүгінгі таңда әзірленген ПТР-ны 1983 жылы доктор Кари Б. Муллис әзірледі. Доктор Маллис сол жылы PE компанияларына қызмет етті, сондықтан ПТР индустриясында PE ерекше мәртебеге ие.Доктор Муллис 1985 жылы Сайки және басқалармен байланысты бірінші мақаланы ресми түрде жариялады. Содан бері ПТР қолдану күніне мыңдаған мильді құрайды және байланысты қағаздардың сапасы көптеген басқа зерттеу әдістерін жағымсыз етеді деп айтуға болады.Кейіннен ПТР технологиясы биологиялық ғылыми зерттеулерде және клиникалық қолдануда кеңінен қолданылып, молекулалық биологияны зерттеудің ең маңызды технологиясына айналды.Маллис сонымен қатар 1993 жылы химия бойынша Нобель сыйлығын жеңіп алды.

ПТРПринцип

ПТР технологиясының негізгі принципі ДНҚ-ның табиғи репликация процесіне ұқсас және оның ерекшелігі мақсатты тізбектің екі ұшына комплементарлы олигонуклеотидті праймерге байланысты.ПТР дегенерация-жандыру-кеңейту үш негізгі реакция сатысынан тұрады: ①Үлгі ДНҚ-ның дегенерациясы: Үлгі ДНҚ белгілі бір уақыт ішінде шамамен 93°C-қа дейін қыздырылғаннан кейін, шаблонды ПТР күшейту нәтижесінде түзілген қос тізбекті ДНҚ үшін қос ДНҚ ерітіндісі оны келесі біріктіруге дайындайтын ДНҚ-ны бір тізбекті қалдыруға дайындайды. дөңгелек реакция.②Үлгі ДНҚ мен праймердің күйдірілуі (қосылысы): Үлгі ДНҚ қызып, бір тізбекке азғындаудан кейін температура шамамен 55°C дейін төмендейді.Праймердің комплементарлы тізбегі және бір тізбекті ДНҚ шаблон.③Праймердің кеңеюі: ДНҚ үлгісі-праймердің байланысуы реакция шикізаты ретінде dNTP болатын TaqDNA полимераза әрекетіне негізделген.Репликация принципін сақтаңыз, үлгі ДНҚ тізбегін толықтыратын жаңа жартылай резервтелген көшірме тізбегін синтездеңіз және қайталанатын цикл дегенерация-жаю-кеңейту-кеңейту үш процесс көбірек «жартылай резервтелген көшірме тізбегін» алуға болады және бұл жаңа тізбек қайтадан қол жетімді Келесі цикл үшін үлгі болыңыз.Циклді аяқтау үшін 2-4 минут қажет, мақсатты генді 2-3 сағат ішінде бірнеше миллион рет күшейтуге болады.

СтандарттыПТРРеакция жүйесі

ПТР реакциясының бес элементі

ПТР реакциясына қатысатын заттардың негізінен бес түрі бар, атап айтқанда праймер, фермент, dNTP, шаблон және буфер (Mg2+ қажет).[ПТР процедурасы]

Стандартты ПТР процесі үш кезеңге бөлінеді

1. ДНҚ дегенерациясы (90°C-96°C): Екі тізбекті ДНҚ шаблондары термиялық әсерде, сутегі байланыстары үзіліп, бір тізбекті ДНҚ түзіледі.

2. Күйдіру (25℃ -65℃): Жүйе температурасы төмендейді, праймер жергілікті қос тізбекті құру үшін ДНҚ үлгісімен біріктіріледі.

3. Кеңейту (70℃ -75℃): Taq ферментінің әсерінен (шамамен 72°C, ең жақсы белсенділік) dNTP шикізат ретінде пайдаланылады, праймердің 5′ ұшынан → 3′ ұшына дейін созылады, синтез және шаблон бір-бірін ДНҚ тізбегін толықтырады.

Әрбір цикл денатуратталған, жасытылған және ұзартылған, ДНҚ мазмұны екі есе артады.Қазіргі уақытта күшейту аймағының қысқа болуына байланысты кейбір ПТР Taq ферментінің белсенділігі оңтайлы болмаса да өте қысқа мерзімде қайталануы мүмкін, сондықтан оны екі кезеңге өзгертуге болады, яғни жасыту және ұзарту бір уақытта 60°C-65°C температурада орындалуы мүмкін.Көтеру және салқындату процесін азайту және жауап беру жылдамдығын жақсарту үшін.

ПТР реакциясының ерекшеліктері

● Жоғары ерекшелік

ПТР реакциясының спецификалық шешуші факторлары: ①Праймер мен үлгі ДНҚ-ның спецификалық комбинациясы.②Негізді жұптастыру принципі.③TaqDNA полимераза синтез реакциясының адалдығы.④Нысаналы геннің ерекшелігі мен консервативтілігі.

Праймерлер мен үлгілердің дұрыс үйлесімі - бұл кілт.Праймер мен шаблонды байланыстыру және праймер тізбегін ұзарту сілтілі негізді сәйкестендіру принципіне негізделген.Полимераза синтезі реакцияларының адалдығы және Taq ДНҚ полимеразасының реакциядағы шаблон мен праймерді байланыстыру (қосылу) үшін жоғары температураға төзімділігі жоғары температурада орындалуы мүмкін.Комбинацияның ерекшелігі айтарлықтай артады.Клип жоғары дәрежедегі дұрыстықты сақтай алады.Консервативтілігі жоғары және консервативтілігі жоғары мақсатты генетикалық аймақты таңдау арқылы оның ерекшелігі жоғары болады.

● Жоғары сезімталдық

ПТР өнімдерінің өндіріс көлемі индекс бойынша ұлғайтылады, ол микроконтроллердің деңгейін микрограмм деңгейіне (μg= -6) дейін көтеру үшін Пикердің (PG=10-12) бастапқы шаблонын кеңейте алады.Мақсатты жасушаларды 1 миллион жасушадан анықтауға болады;вирустарды анықтау кезінде ПТР сезімталдығы 3 RFU жетуі мүмкін (бірліктер құрылатын бос нүктелер);бактерия ғылымындағы ең аз анықтау жылдамдығы 3 бактерияны құрайды.

● Қарапайым және жылдам

ПТР шағылысуы реакция ерітіндісін бір уақытта қосатын жоғары температуралы Taq ДНҚ полимеразасын пайдаланады, яғни ДНҚ күшейту ерітіндісі мен су моншасы кастрюльіндегі дегенерация-аннеальды-кеңейту реакциясы.Әдетте күшейту реакциясы 2-4 сағатта аяқталады.Толықтырылған өнімдер әдетте электрлік қылышпен талданады және изотоптарды пайдаланудың қажеті жоқ, радиоактивті ластану жоқ және оңай жылжыту.

● Үлгінің тазалығы төмен

Вирустарды немесе бактерияларды және культура жасушаларын бөлудің қажеті жоқ.Күшейткіш ретінде ДНҚ шикі өнімдері мен РНҚ қолданылуы мүмкін.ДНҚ күшейтуін анықтауды қан, дене сұйықтығы, жөтелді жууға арналған сұйықтық, шаш, жасушалар және тірі тін сияқты клиникалық үлгілер арқылы тікелей пайдалануға болады.

ПТРжалпы проблемалар

● Жалған теріс, күшейтілген жолақтар жоқ

ПТР реакциясының негізгі кезеңдері мыналарды қамтиды: ① шаблонды нуклеин қышқылдарын дайындау, ② праймерлердің сапасы мен ерекшелігі, ③ ферменттердің сапасы ④ ПТР циклінің шарттары.Себебін табу жоғарыдағы сілтемелер үшін де талданып, зерттелуі керек.

Үлгілер: ① Үлгіде әртүрлі ақуыз бар, ② Үлгіде Taq ферментінің ингибиторы бар, ③ Үлгідегі ақуыз жойылмайды, әсіресе хромосомадағы топтық ақуыз.⑤ Деминер нуклеин қышқылының дегенерациясы толық емес.Ферменттер мен праймерлердің сапасы жақсы болған кезде күшейту жолағы болмайды, бұл үлгілерді ас қорытуды өңдеу болып табылады.Үлгі нуклеин қышқылын алу процесінде бірдеңе дұрыс емес, сондықтан тиімді және тұрақты ас қорыту ерітіндісін дайындау үшін оның процедурасы бекітіліп, ерікті түрде өзгертілмеуі керек.

Ферментті инактивациялау: жаңа ферментті немесе ескі және жаңа ферменттердің екеуін бірге пайдаланып, фермент белсенділігінің жоғалғанын немесе жеткіліксіздігін, жалған теріс нәтижелерге әкелетінін талдау керек.Айта кету керек, Taq ферменті немесе этидий бромиді кейде ұмытылады.

Праймер: праймердің сапасы, праймердің концентрациясы және екі праймердің концентрациясы симметриялы ма.Бұл ПТР сәтсіздігінің жалпы себебі немесе ұлғаю жолағы идеалды емес және диффузияға бейім.Кейбір сериялық нөмірлердің праймерлерінің сапасына қатысты мәселелер бар.Екі праймер жоғары концентрацияға және төмен концентрацияға ие, бұл төмен тиімділікті асимметриялық күшейтуді тудырады.Қарсы шаралар: ① Бірліктерді синтездеу үшін жақсы праймерді таңдаңыз.② Праймердің концентрациясы тек OD мәніне байланысты емес, сонымен қатар агар қант гелінің электрофорезін жасау үшін праймердің бастапқы сұйықтығына назар аударады.Праймер жолағы аймағы болуы керек және екі праймердің жарықтығы жалпы түрде сәйкес болуы керек.Белбеу, ПТР осы уақытта сәтсіз болуы мүмкін және оны праймер синтезі блогымен шешу керек.Егер праймер жоғары болса, жарықтығы төмен, сұйылтылған кезде оның концентрациясы теңестірілуі керек.③ Тоңазытқыштың бірнеше қатып қалуын немесе ұзақ уақыт тоңазытқыш бөліктерін болдырмау үшін праймерді төлеу және оны жоғары концентрацияда сақтау керек, бұл праймердің нашарлауына және тозуына әкеледі.④ Праймердің дизайны негізсіз, мысалы, праймердің ұзындығы жеткіліксіз және праймерлердің арасында ди кластер пайда болады.

Mg2+концентрациясы: Mg2+ион концентрациясы ПТР күшейту тиімділігіне үлкен әсер етеді.Шамадан тыс концентрация ПТР күшейтуінің қарама-қарсы жынысын төмендетуі мүмкін.Егер концентрация тым төмен болса, ПТР күшейту шығысы тіпті кеңейту жолағынсыз ПТР күшейту сәтсіздігін тудырады.

Реакция көлемінің өзгеруі: ПТР күшейтуде қолданылатын көлем 20ul, 30ul және 50ul немесе 100uL, ПТР күшейтуге арналған өтінімнің үлкен көлемі ғылыми зерттеулер мен клиникалық сынақтардың әртүрлі мақсаттарына сәйкес белгіленеді.20ул сияқты кішігірім көлемдерді жасағаннан кейін өлшемін жасағанда шнур жағдайын жасау керек, әйтпесе ол сәтсіздікке ұшырайды.

Физикалық себептер: ПТР күшейту үшін трансформация өте маңызды.Егер деградация температурасы төмен болса, азғындау уақыты қысқа болса, ол жалған негативтерде болуы ықтимал;тым төмен жасыту температурасы спецификалық емес күшейтуді тудыруы және арнайы күшейту тиімділігін төмендетуі мүмкін.ПТР күшейту тиімділігін төмендету үшін праймерлер мен үлгілердің комбинациясына жоғары әсер етеді.Кейде ұзартқыштағы немесе суда еритін пештегі өзгермелілікті, күйдіруді және ұзартылған температураны анықтау үшін стандартты термометрлерді пайдалану қажет, бұл ПТР сәтсіздігінің себептерінің бірі болып табылады.

Мақсатты реттілік нұсқалары: Егер мақсатты реттілік орын алса, мутация немесе жою, прототип пен үлгінің комбинациясы біріктірілсе немесе мақсатты тізбектің болмауына байланысты праймер мен үлгі қосымша ретті жоғалтады және оның ПТР күшейтуі сәтті болмайды.

● Жалған оң

ПТР күшейту жолағы мақсатты реттілік жолағына сәйкес болып көрінеді, кейде оның жолағы ұқыпты және жоғарырақ болады.

Праймер дизайны сәйкес емес: таңдалған күшейту тізбегі мен мақсатты емес күшейту реті гомологқа ие, сондықтан ПТР күшейту кезінде күшейтілген ПТР өнімдері мақсатты емес тізбектер болып табылады.Мақсатты реттілік тым қысқа немесе праймер тым қысқа және ол жалған позитивке бейім.Қайта жобалау керек.

Мақсатты реттілік немесе күшейту өнімдерінің айқас ластануы: Бұл ластанудың екі себебі бар: Біріншіден, жалған позитивтерге әкелетін бүкіл геномның немесе үлкен сегменттердің көлденең ластануы.Жалған позитивтің бұл түрін келесі әдістермен шешуге болады: Нысаналы тізбектің үлгілік пистолетке ингаляциялануын немесе орталықтан тепкіш түтіктен шашырауын болдырмау үшін жұмыс кезінде абай болыңыз және жұмсақ болыңыз.Жоғары температураға төтеп бере алмайтын ферменттер мен заттарды қоспағанда, барлық реагенттер немесе жабдықтар жоғары қысыммен дезинфекциялануы керек.Ортадан тепкіш құбырлар мен үлгілерді бір уақытта пайдалану керек.Қажет болған жағдайда үлгілерді қоспас бұрын реакция түтігі мен реагент бар нуклеин қышқылын жою үшін ультракүлгін сәулелердің әсеріне ұшырайды.Екіншіден, ауаның ластануындағы ұсақ фрагменттер.Бұл шағын фрагменттер мақсатты тізбектен қысқа, бірақ олардың белгілі бір гомологиясы бар.Оны бір-бірімен біріктіруге болады.Праймерлерді толықтырғаннан кейін ПТР өнімін кеңейтуге болады, бұл жалған оң өндірісті тудырады.Оны ұялы ПТР әдісін азайту немесе жою үшін пайдалануға болады.

● Арнайы емес күшейту жолағы пайда болады

ПТР күшейтуінен кейін пайда болған жолақтар күтілетін өлшемге сәйкес келмейді, немесе үлкен немесе кіші, немесе бір уақытта немесе бір уақытта, нақты күшейту жолақтары мен спецификалық емес күшейту жолақтары.Арнайы емес жолақтардың пайда болуы: Біріншіден, праймерлер мақсатты реттілікке толық емес комплементарлы немесе ди кластерді қалыптастыру үшін праймердің полимерленуі.Екіншісі, MG2+ иондарының концентрациясы тым жоғары, күйдіру температурасы тым төмен және ПТР циклдарының саны өзара байланысты.Екіншіден, ферменттердің сапасы мен мөлшері.Көбінесе кейбір көздердің ферменттері арнайы емес жолақтарға бейім, ал басқа көздің ферменттері пайда болмайды.Кейде ферменттердің спецификалық емес күшейтуі де орын алады.Қарсы шаралар: қажет болған жағдайда қайта жобаланған тартымдылықтар.Фермент мөлшерін азайтыңыз немесе басқа көздің ферментін ауыстырыңыз.Бастапқы мөлшерді азайтыңыз, үлгілер санын сәйкесінше көбейтіңіз және циклдар санын азайтыңыз.Жасыту температурасын дұрыс арттырыңыз немесе екі температура нүктесі әдісін қолданыңыз (93°C дегенерация, жасыту және шамамен 65°C ұзарту).

● Қабыршақ немесе жағылған таспа пайда болады

ПТР күшейту кейде қолданылатын немесе қабықшалы немесе кілем тәрізді белбеу сияқты көрінеді.Себебі, ферменттердің шамадан тыс мөлшерінен немесе фермент сапасының нашарлығынан dNTP концентрациясы тым жоғары, Mg2+ концентрациясы тым жоғары, күйдіру температурасы тым төмен, цикл саны тым көп.Қарсы шаралар: ①Ферменттердің мөлшерін азайту немесе басқа көздің ферментін өзгерту.②dNTP концентрациясын төмендетіңіз ③Mg2+ концентрациясын дұрыс төмендетіңіз.④Үлгілер санын көбейтіп, циклдар санын азайтыңыз.

қосымша тауарлар

ПТР Heroᵀᴹ (Бояғышпен)

◮ Жоғары сенімділік: қарапайым Taq ферментінен 6 есе жоғары;

◮ Жылдамырақ күшейту жылдамдығы

◮ Үлгіге көбірек бейімделу

◮ Күшейтудің жоғары тиімділігі

◮ Қоршаған ортаға төзімділік күштірек: 90% -дан астам белсенділікті сақтай отырып, бір апта бойы 37 ° C температурада орналастырылған;

◮ Оның 5'→3' ДНҚ-полимераза белсенділігі және 5'→3' экзонуклеаза белсенділігі бар, 3'→5' экзонуклеаза белсенділігі жоқ.

ПТР Easyᵀᴹ (бояғышпен)

Бірегей реакция жүйесі және жоғары тиімді Taq DNA Polymerase ПТР реакциясын күшейту тиімділігі, ерекшелігі және сезімталдығы жоғары етеді.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Бір қадам)-SYBR Green I

◮ Бір қадамдық жинақ бір түтікте кері транскрипция мен qPCR екі реакциясын жасайды, тек РНҚ шаблонын, арнайы ПТР праймерлерін және RNase-Free ddH қосу қажет.₂O.

◮ Жинақ вирустық РНҚ-ны немесе РНҚ ізін жылдам және тиімді сандық талдай алады.

◮ Жинақ күшейту тиімділігі мен реакцияның ерекшелігін тиімді жақсарту үшін бірегей реакция жүйесімен біріктірілген Foregene кері транскрипцияның бірегей реагентін және Foregene HotStar Taq ДНҚ полимеразасын пайдаланады.

◮ Оңтайландырылған реакция жүйесі реакцияның жоғары анықтау сезімталдығына, күшті термиялық тұрақтылыққа және жақсы төзімділікке ие етеді.

◮ RT-qPCR Easy^TM(Бір қадам)-SYBR Green I жинағы ROX ішкі анықтамалық бояуымен бірге жеткізіледі, ол ұңғымалар арасындағы сигналдық фон мен сигнал қателерін жою үшін пайдаланылуы мүмкін, бұл тұтынушыларға сандық ПТР құралдарының әртүрлі үлгілерінде қолдануға ыңғайлы.

RT Оңай^TMII (Мастер премикс үшін бірінші тізбекті кДНҚ синтезіНақты уақыттағы ПТР)

- Үлгідегі гДНҚ-ны 2 минут ішінде жоя алатын гДНҚ-ны жоюдың тиімді мүмкіндігі.

-Тиімді кері транскрипция жүйесі, бірінші cDNA тізбегінің синтезін аяқтау үшін небәрі 15 минут қажет.

-Күрделі үлгілер: жоғары GC мазмұны және күрделі қайталама құрылымы бар үлгілерді жоғары тиімділікпен өзгертуге болады.

-Жоғары сезімталдықты кері транскрипция жүйесі, pg деңгейіндегі үлгілер де жоғары сапалы cDNA ала алады.

- Кері транскрипция жүйесі жоғары термиялық тұрақтылыққа ие, оңтайлы реакция температурасы 42 ℃ және 50 ℃ температурада кері транскрипцияның жақсы өнімділігі бар.