RT-qPCR молекулалық биологияның негізгі эксперименті болып табылады және онымен әркім таныс болуы керек.Ол негізінен үш қадамды қамтиды: РНҚ экстракциясы, кДНҚ-ға кері транскрипция және нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР.Бұл көмектеспейді, не болып жатыр?Мәселе бар шығаркері транскрипция тәжірибесі!Кері транскрипция тәжірибесі тек РНҚ, dNTP, праймерлерді жәнекері транскриптазацентрифуга түтігіне және жақсылап араластырыңыз, бірақ нақты жұмыс процесінде әлі де назар аударуды қажет ететін көптеген бөлшектер бар.Бұл туралы білейік!

РНҚ сапасын қалай бағалауға болады?
cDNA алу үшін РНҚ сапасы өте маңызды!РНҚ сапасын негізінен екі аспектіден анықтауға болады:
(1) РНҚ тұтастығы:РНҚ тұтастығын агарозды гель электрофорезі арқылы тексеруге болады. Мысал ретінде эукариоттарды алатын болсақ, толық жалпы РНҚ-ның үш анық жолағы бар, молекулалық салмағы үлкеннен кішіге дейін 28S, 18S және 5S, ал 28S 18S-тен екі есе жарқын;егер үш жолақ көрінсе, бірақ жолақ түрі бұлыңғыр болса немесе Диффузия РНҚ ішінара бұзылғанын білдіреді.Осы уақытта кері транскрипция реакциясын дереу орындаңыз және үлгі енгізуін сәйкесінше арттырыңыз;егер тек шағын молекулалық массасы бар жолақ немесе жолақ көрінбесе, РНҚ толығымен бұзылған және оны қайта алу қажет.Agilent 2100 шың диаграммасы және RIN мәні бар РНҚ тұтастығын көрсетеді.Нуклеин қышқылы бүтін болса, электроферограмманың негізгі сызығы тегіс болады;егер нуклеин қышқылы қатты бұзылса, негізгі сызық біркелкі емес және одан да көп деградация шыңдары пайда болады;RIN мәні РНҚ-ның тұтастығын көрсетеді, 0-10 диапазонында, мән неғұрлым үлкен болса, РНҚ сапасы соғұрлым жақсы болады.Ал, толықтық дәрежесі соғұрлым жоғары болады.
(2) РНҚ тазалығы:OD260/280 қатынасын ультракүлгін спектрофотометрия арқылы анықтауға болады.Егер OD260/280 қатынасы 1,9 мен 2,1 арасында болса, тазалық өте жақсы.
Қалдық геномдық ДНҚ дұрыс емес сандық нәтижелерге әкелуі мүмкін
РНҚ алынған кезде, біз алған РНҚ тазартылмаған геномдық ДНҚ-мен (gDNA) араласуы мүмкін.Сондықтан кері транскрипциядан кейінгі cDNA да араласадыгДНҚ.Төменгі ағын кезіндеqPCRреакция,cDNAжәне гДНҚ бір уақытта күшейтілуі мүмкін, бұл салыстырмалы түрде аз CT мәніне әкеледі, сондықтан нәтижелер біржақты болуы мүмкін.
Сонымен, бұл жағдайда не істеуіміз керек?Шетелдікұсынады:
(1) РНҚ экстракциясы кезінде бағанды ​​экстракциялау арқылы жойылуы мүмкін кері РНҚ-да геномды тазалауды орындау;
(2) Алынған РНҚ-ны DNase көмегімен өңдеңізI , бірақ оны EDTA арқылы аяқтаңыз;
кері транскрипция реагенттерігеномды тазарту модульдерімен;

Кері транскрипция үшін праймерлерді қалай таңдауға болады?
Кері транскрипцияның праймерлері кері транскрипция реакциясының нәтижесіне де әсер етеді.Тәжірибенің нақты жағдайларына сәйкес кері транскрипция үшін кездейсоқ праймерлерді, Oligo dT немесе генге тән праймерлерді таңдауға болады:
(1) Арнайы транскрипттер: генге тән праймерлер ұсынылады;
(2) Ұзын үзінді транскрипттері: Oligo dT/генге тән праймерлер ұсынылады;
(3) Ұзын сегментті транскрипттердің ішкі фрагменттері: генге тән праймерлер/ кездейсоқ праймерлер /кездейсоқ праймерлер + Oligo dT.Келесі qPCR эксперименті орындалса, Oligo dT жалғыз пайдаланылуы мүмкін емес, өйткені жалғыз Oligo dT пайдалану 3′ соңындағы ауытқуды тудыруы мүмкін, бұл qPCR экспериментінің дәл емес нәтижелеріне әкеледі;
(4) миРНҚ: Бағаналы ілмекті праймерлерді немесе қалдық праймерлерді пайдалануға болады.

Кері транскрипция өнімі cDNA сандық анықтау үшін қанша рет сұйылту керек?
Кері транскрипция өнімінің кДНҚ-сын алғаннан кейін qPCR тәжірибелері үшін кДНҚ-ны қанша рет сұйылту керек екендігі өте маңызды.Егер cDNA концентрациясы тым жоғары немесе тым төмен болса, күшейту тиімділігіне әсер етуі мүмкін.cDNA концентрациясын өлшеуге бола ма және оны қалай жасау керек?
(1) Кері транскрипция өнімінің cDNA концентрациясын өлшеу мүмкін емес, себебі cDNA өнімінен басқа кері транскрипция өнімінде кері транскрипцияның қалдық буфері, кері транскриптаза, праймерлер және т.б. бар, олар концентрацияны өлшеу нәтижелеріне кедергі келтіреді және OD260/280, сондықтан OD260/280 нормасын көрсетпейді және OD260yi/el қалыпты емес.Осы уақытта кейбір достар айтады, содан кейін мен тазартудан кейін концентрацияны өлшеймін;мұнда, Foregene cDNA тазартуға ұсынылмайтынын еске салғысы келеді, өйткені реверсация арқылы алынған кДНҚ ұзындығы әртүрлі, ал қысқа кДНҚ тазарту кезінде жоғалады.
(2) Сонымен не істеу керек?qPCR тәжірибесіне дейін cDNA сұйылту градиентін алдын ала эксперимент арқылы анықтауға болады.Мысалы: qPCR тәжірибелері үшін үлгі ретінде cDNA қор ерітіндісін, 10 есе сұйылтуды және 100 есе сұйылтуды пайдаланыңыз және CT мәні 18-28 диапазонында сұйылту коэффициентін таңдаңыз.

МиРНҚ қалай кері транскрипциялануы керек?
miRNA - бұл ақуызды кодтамайтын, өлшемі шамамен 22 нт болатын бір тізбекті шағын молекулалы РНҚ.Ұзындығы қысқа болғандықтан, әдеттегі qPCR әдісі оны тікелей сандық анықтау қиын, сондықтан жиі миРНҚ-ны ұзарту қажет;миРНҚ үшін жиі қолданылатын кері транскрипция әдістеріне бағаналы цикл әдісі және қалдық әдісі жатады.
Бағаналы цикл әдісі - діңгек-ілмек праймерлерін қосу арқылы miRNA кеңейту.Бұл анықтау әдісі жоғары сезімталдық пен ерекшелікке ие, бірақ анықтау өткізу қабілеті төмен.Бір кері транскрипция тек бір miRNA және ішкі сілтемені анықтай алады;құйрықты қосу әдісі екіден тұрады. Ол екі ферменттің бірлескен әрекетімен аяқталады, олар полиА полимераза және кері транскриптаза.ПолиА полимераза ұзындығын ұлғайту үшін миРНҚ-ға PolyA құйрықтарын қосуға жауап береді, ал кері транскриптаза кері транскрипция реакциясын орындайды.Бұл әдіс анықтаудың жоғары өткізу қабілетіне ие және бір кері транскрипцияда бірнеше miRNA және ішкі сілтемелерді анықтай алады, бірақ діңдік цикл әдісінде сезімталдық пен ерекшелік төмен.