ПТР – ең көп қолданылатын нуклеин қышқылын күшейту технологиясы және оның сезімталдығы мен ерекшелігіне байланысты кеңінен қолданылады.Дегенмен, ПТР қайталанатын термиялық денатурацияны қажет етеді және аспап пен жабдыққа сүйену шектеулерінен құтыла алмайды, бұл оның клиникалық далалық сынақта қолданылуын шектейді.

1990 жылдардың басынан бастап көптеген зертханалар термиялық денатурацияны қажет етпейтін тұрақты температураны күшейту технологиясын жасай бастады.Енді олар цикл арқылы изотермиялық күшейту технологиясын, жіпті алмастыратын изотермиялық күшейту технологиясын, айналмалы шеңбердің изотермиялық күшейту технологиясын және нуклеин қышқылының тізбектілігіне тәуелділігін әзірледі.Изотермиялық күшейту технологиясы және басқа технологиялар. 

Loop арқылы изотермиялық күшейту

Күшейту принципі ДНҚ-ның шамамен 65°С температурада динамикалық тепе-теңдік күйінде болуына негізделген.Кез келген праймер негіздік жұптастырылған және қос тізбекті ДНҚ-ның комплементарлы бөлігіне ұзартылған кезде, екінші тізбек диссоциацияланып, бір тізбекті болады.

Бұл температурада ДНҚ тізбекті ығыстырушы ДНҚ-ның синтезін үздіксіз айналу үшін тізбекті ығыстырушы ДНҚ полимеразасына сүйену үшін 4 арнайы праймерді пайдаланады.

Алдымен мақсатты гендегі 6 нақты аймақты F3, F2, F1, B1, B2, B3 анықтаңыз, содан кейін осы 6 нақты аймаққа негізделген 4 праймерді жобалаңыз (төмендегі суретте көрсетілгендей):

Алға ішкі праймер (FIP) F1c және F2-ден тұрады.

Артқы ішкі праймер (BIP) B1c және B2-ден тұрады, ал TTTT ортасында бос орын ретінде пайдаланылады.

F3 және B3 сыртқы праймерлері мақсатты гендегі F3 және B3 аймақтарынан тұрады.

LAMP реакция жүйесінде ішкі праймердің концентрациясы сыртқы праймерден бірнеше есе көп.Ішкі праймер алдымен шаблон тізбегімен біріктіріліп, ДНҚ қос тізбегін қалыптастыру үшін комплементарлы тізбекті синтездейді.Кейіннен сыртқы праймер ДНҚ қос тізбегін қалыптастыру үшін шаблондық тізбекпен біріктіріледі.BstDNA-полимеразаның әсерінен ішкі праймермен синтезделген комплементарлы тізбек бөлінеді.Бірқатар реакциялардан кейін комплементарлы тізбек соңында гантель құрылымы бар бір ДНҚ тізбегін құрайды.

Гантель құрылымы ДНҚ бір жіпшенің өзі ашық ұшы бар ДНҚ өтпелі діңгек-ілмек құрылымын үздіксіз қалыптастыру үшін үлгі ретінде пайдаланылады.Ішкі және сыртқы праймерлер ДНҚ-ның өтпелі діңгек-ілмек құрылымын тізбекті ауыстыру және ұзарту реакцияларынан үздіксіз өтуге бағыттайды және соңында әртүрлі ұзындықтағы бірнеше діңгек-ілмек құрылымдарын құрайды.ДНҚ қоспасы.

Контур арқылы изотермиялық күшейтудің артықшылықтары мен кемшіліктері

LAMP артықшылықтары:

(1) 1 сағат ішінде мақсатты геннің 1-10 көшірмесін тиімді түрде күшейте алатын жоғары күшейту тиімділігі және күшейту тиімділігі қарапайым ПТР-дан 10-100 есе жоғары.

(2) Реакция уақыты қысқа, ерекшелігі күшті және арнайы жабдық қажет емес.

LAMP кемшіліктері:

(1) Праймерлерге қойылатын талаптар әсіресе жоғары.

(2) Күшейтілген өнімді клондау және секвенирлеу үшін пайдалануға болмайды, бірақ оны тек пайымдау үшін пайдалануға болады.

(3) Күшті сезімталдықтың арқасында аэрозоль түзілуі оңай, бұл жалған позитивтерді тудырады және сынақ нәтижелеріне әсер етеді.

Sтранді ауыстыруды күшейту

Жіпті ауыстыруды күшейту (SDA) - 1992 жылы американдық ғалым Уокер алғаш рет ұсынған ферментативті реакцияға негізделген in vitro изотермиялық ДНҚ күшейту әдісі.

SDA негізгі жүйесіне рестрикциялық эндонуклеаза, тізбекті ауыстыру белсенділігі бар ДНҚ-полимераза, екі жұп праймер, dNTP, кальций мен магний иондары мен буферлік жүйелер кіреді.

Тізбекті ауыстыруды күшейту принципі мақсатты ДНҚ-ның екі шетіндегі химиялық модификацияланған рестрикциялық эндонуклеазаны тану тізбегіне негізделген.Эндонуклеаза тану орнында ДНҚ тізбегіндегі саңылауды ашады, ал ДНҚ полимераза 3′ аралықты ұзартады және келесі ДНҚ тізбегін ауыстырады.

ДНҚ-ның ауыстырылған бір тізбектері праймерлермен біріктіріліп, ДНҚ-полимераза арқылы қос тізбектерге ұзартылуы мүмкін.Бұл процесс үздіксіз қайталанады, осылайша мақсатты реттілік тиімді түрде күшейтіледі.

Жіпті ауыстыруды күшейту технологиясының артықшылықтары мен кемшіліктері

SDA артықшылықтары:

Күшейтудің тиімділігі жоғары, реакция уақыты қысқа, ерекшелігі күшті және арнайы жабдық қажет емес.

SDA кемшіліктері:

Өнімдер біркелкі емес, кейбір бір жіпті және екі тізбекті өнімдер әрқашан SDA циклінде шығарылады және электрофорез арқылы анықталған кезде қалдық сөзсіз болады.

Rоллинг шеңберін күшейту

Айналмалы шеңберді күшейту (RCA) айналмалы шеңбер арқылы патогенді организмдерден ДНҚ көшіру әдісіне сүйене отырып ұсынылады.Ол тұрақты температурада шаблон ретінде бір тізбекті дөңгелек ДНҚ-ны және арнайы ДНҚ-полимеразаны (мысалы, Phi29) пайдалануды білдіреді ) Домалау шеңберінің әсерінен мақсатты геннің күшейтілуіне қол жеткізу үшін ДНҚ синтезі.

RCA сызықтық күшейту және экспоненциалды күшейту деп бөлуге болады.Сызықтық RCA тиімділігі 10-ға жетуі мүмкін⁵есе, ал экспоненциалды RCA тиімділігі 10-ға жетуі мүмкін⁹рет.

Қарапайым айырмашылық, төмендегі суретте көрсетілгендей, сызықтық күшейту a тек 1 праймерді пайдаланады, экспоненциалды күшейту b үшін 2 праймер бар.

Сызықтық RCA бір праймер RCA деп те аталады.Праймер дөңгелек ДНҚ-мен байланысады және ДНҚ-полимеразаның әсерінен ұзарады.Өнім бір ілмектің ұзындығынан мыңдаған есе көп қайталанатын тізбектердің үлкен саны бар сызықты жалғыз жіп.

Сызықтық RCA өнімі әрқашан бастапқы праймерге қосылғандықтан, сигналды оңай бекіту басты артықшылық болып табылады.

Экспоненциалды RCA, сондай-ақ Гипер тармақталған күшейту HRCA (Гипер тармақталған RCA) ретінде белгілі, экспоненциалды RCA-да бір праймер RCA өнімін күшейтеді, екінші праймер RCA өнімімен гибридтенеді және ұзарады, ал ауыстыру RCA өніміне әлдеқашан байланады.

Домалау шеңберінің нуклеин қышқылын күшейтудің артықшылықтары мен кемшіліктері

RCA артықшылықтары:

Жоғары сезімталдық, жақсы спецификалық және оңай жұмыс.

RCA кемшіліктері:

Сигналдарды анықтау кезіндегі фондық мәселелер.RCA реакциясы кезінде айналма құлыптау зонд және байланыспаған зондтың үлгі ДНҚ немесе РНҚ кейбір фондық сигналдарды тудыруы мүмкін. 

Nнуклеицидтер тізбегіне негізделген күшейту

Нуклеин қышқылының реттілігіне негізделген күшейту (NASBA) – ПТР негізінде жасалған жаңа технология.Бұл T7 промотор тізбегі бар праймерлер жұбымен басқарылатын нуклеин қышқылының үздіксіз және изотермиялық күшейтуі.Технология РНҚ шаблонын шамамен 2 сағатта шамамен 109 есе күшейте алады, бұл әдеттегі ПТР әдісінен 1000 есе жоғары және арнайы жабдықты қажет етпейді.

Бұл технология пайда болғаннан кейін ауруларды жылдам диагностикалау үшін қолданылды және қазіргі уақытта көптеген компаниялар бұл әдісті РНҚ анықтау жинақтарында қолданады.

РНҚ күшейту кері транскрипциялық ПТР технологиясын да қолдана алатынына қарамастан, NASBA-ның өзіндік артықшылықтары бар: ол салыстырмалы түрде тұрақты температура жағдайында жүзеге асырылуы мүмкін және ол дәстүрлі ПТР технологиясына қарағанда тұрақты және дәл.

Реакция 41 градус Цельсийде және аяқталу үшін AMV (құс миелобластозы вирусы) кері транскриптаза, RNase H, T7 РНҚ полимераза және жұп праймер қажет.

Процесс негізінен мыналарды қамтиды:

Алға праймерде T7 промоутерінің қосымша тізбегі бар.Реакция кезінде алға праймер РНҚ тізбегімен байланысады және ДНҚ-РНҚ қос тізбегін қалыптастыру үшін AMV ферментімен катализденеді.

RNase H гибридті қос тізбектегі РНҚ-ны қорытады және бір тізбекті ДНҚ-ны сақтайды.

Кері праймер мен AMV ферментінің әсерінен құрамында T7 промотор тізбегі бар ДНҚ қос тізбегі түзіледі.

T7 РНҚ полимеразасының әсерінен транскрипция процесі аяқталып, мақсатты РНҚ-ның көп мөлшері түзіледі.

NASBA артықшылықтары:

(1) Оның праймерінде T7 промоторлар тізбегі бар, бірақ шетелдік қос тізбекті ДНҚ-да T7 промоторлар тізбегі жоқ және оны күшейту мүмкін емес, сондықтан бұл технология жоғары ерекшелік пен сезімталдыққа ие.

(2) NASBA кері транскрипция процесін күшейту реакциясына тікелей енгізіп, реакция уақытын қысқартады.

NASBA кемшіліктері:

(1) Реакция компоненттері күрделірек.

(2) Реакция құнын жоғарылату үшін үш түрлі фермент қажет.