Ct мәні флуоресцентті сандық ПТР нәтижесін көрсетудің ең маңызды түрі болып табылады.Ол ген экспрессиясының айырмашылығын немесе геннің көшірме санын есептеу үшін қолданылады.Сонымен, флуоресценцияның Ct мәні қандай деп саналады?Ct мәнінің тиімді диапазонын қалай қамтамасыз етуге болады?
Ct мәні дегеніміз не?
qPCR күшейту процесі кезінде күшейтілген өнімнің флуоресценция сигналы орнатылған флуоресценция шегіне жеткенде күшейту циклдарының сәйкес саны (Цикл шегі).C Cycle және T - Threshold дегенді білдіреді.Қарапайым тілмен айтқанда, Ct мәні - бастапқы үлгіні күшейту qPCR-де өнімнің белгілі бір мөлшеріне жеткен кездегі сәйкес циклдер саны.«Өнімнің белгілі бір мөлшері» деп аталатын нәрсе кейінірек түсіндіріледі.
Ct мәні не істейді?
1. Көрсеткіштік күшейту, шаблон мөлшері және Ct мәні арасындағы байланыс
Ең дұрысы, qPCR-дағы гендер циклдердің белгілі бір санынан кейін экспоненциалды күшейту арқылы жинақталады.Күшейту циклдерінің саны мен өнімдердің саны арасындағы байланыс: Күшейтілген өнім мөлшері = бастапқы үлгі мөлшері × (1+En) циклдар саны.Дегенмен, qPCR реакциясы әрқашан идеалды жағдайда бола бермейді.Күшейтілген өнім мөлшері «белгілі бір өнім мөлшеріне» жеткенде, осы уақыттағы циклдар саны Ct мәні болып табылады және ол экспоненциалды күшейту кезеңінде болады.Ct мәні мен бастапқы шаблон мөлшері арасындағы байланыс: Үлгінің Ct мәні мен үлгінің бастапқы көшірме нөмірі логарифмінің арасында сызықтық байланыс бар.Шаблонның бастапқы концентрациясы неғұрлым жоғары болса, Ct мәні соғұрлым аз болады;шаблонның бастапқы концентрациясы неғұрлым төмен болса, соғұрлым Ct мәні үлкен болады.
2.Күшейту қисығы, флуоресценция шегі және белгілі ПТР өнім мөлшері
qPCR күшейту өнімінің мөлшері тікелей флуоресцентті сигнал түрінде, яғни күшейту қисығы түрінде көрсетіледі.ПТР ерте сатысында күшейту идеалды жағдайда жүреді, циклдар саны аз, өнімнің жинақталуы аз, флуоресценция деңгейін флуоресценция фонынан анық ажырату мүмкін емес.Осыдан кейін флуоресценция артып, экспоненциалды фазаға өтеді.ПТР өнімінің мөлшерін ПТР реакциясы экспоненциалды фазада болған кезде белгілі бір нүктеде анықтауға болады, оны «өнімнің белгілі бір мөлшері» ретінде пайдалануға болады және шаблонның бастапқы мазмұнын осыдан шығаруға болады.Демек, өнімнің белгілі бір мөлшеріне сәйкес келетін флуоресценция сигналының қарқындылығы флуоресценция шегі болып табылады.
ПТР соңғы сатысында күшейту қисығы экспоненциалды күшейтуді көрсетпейді және сызықтық фазаға және плато фазасына енеді.
3. Ct мәндерінің қайталануы
ПТР циклі Ct мәнінің цикл нөміріне жеткенде, ол нағыз экспоненциалды күшейту кезеңіне енді ғана кірді.Осы уақытта кішігірім қате күшейтілген жоқ, сондықтан Ct мәнінің қайталану мүмкіндігі тамаша, яғни бір шаблон әртүрлі уақытта немесе әртүрлі түтіктерде бір уақытта күшейтіледі.Күшейту, алынған Ct мәні тұрақты.
1.Күшейту тиімділігі En
ПТР күшейту тиімділігі полимеразаның күшейтілетін генді ампликонға түрлендіру тиімділігін білдіреді.Бір ДНҚ молекуласы екі ДНҚ молекуласына айналғанда күшейту тиімділігі 100% құрайды.Күшейтудің тиімділігі әдетте En ретінде көрсетіледі.Келесі мақалаларды талдауды жеңілдету үшін күшейту тиімділігіне әсер ететін факторлар қысқаша енгізілді.
| Әсер етуші факторлар | түсіндіру | Қалай үкім шығару керек? |
| A. ПТР ингибиторлары | 1. ДНҚ шаблонында ақуыздар немесе жуғыш заттар сияқты ПТР реакциясын тежейтін заттар бар.2. Кері транскрипциядан кейінгі кДНҚ келесі ПТР реакциясын тежей алатын үлгілік РНҚ немесе RT реагент компоненттерінің жоғары концентрациясын қамтиды. | 1. Ластанудың бар-жоғын A260/A280 және A260/A230 немесе РНҚ электрофорезінің арақатынасын өлшеу арқылы анықтауға болады.2. Кері транскрипциядан кейін кДНҚ белгілі қатынасқа сәйкес сұйылтылған ба. |
| B. Праймердің дұрыс жасалмауы | Праймерлер тиімді күйдірмейді | Праймер-димерлер немесе шаш қыстырғыштары, сәйкессіздіктер және кейде интроникалық дизайнды қамтитын праймерлерді тексеріңіз. |
| C. ПТР реакциясының дұрыс емес бағдарламасы | 1. Праймерлер тиімді күйдіре алмайды2. ДНҚ полимеразаның жеткіліксіз бөлінуі 3. Ұзақ уақыт жоғары температурадағы ДНҚ полимераза белсенділігі төмендеді | 1. Жасыту температурасы праймердің ТМ мәнінен жоғары2. Денатурацияға дейінгі уақыт өте қысқа 3. Реакция процедурасының әр кезеңінің уақыты тым ұзақ |
| D. Реагенттерді жеткіліксіз араластыру немесе тамшуырлау қателері | Реакция жүйесінде ПТР реакциясы компоненттерінің жергілікті концентрациясы тым жоғары немесе біркелкі емес, нәтижесінде ПТР күшейту экспоненциалды емес күшейтіледі. | |
| E. Ампликон ұзындығы | Ампликонның ұзындығы тым ұзын, 300бит-тен асады және күшейту тиімділігі төмен | Ампликон ұзындығының 80-300bp арасында екенін тексеріңіз |
| F. qPCR реагенттерінің әсері | Реагенттегі ДНҚ-полимераза концентрациясы төмен немесе буфердегі иондардың концентрациясы оңтайландырылмаған, нәтижесінде Taq ферментінің белсенділігі максимумға жетпейді. | Стандартты қисық арқылы күшейту тиімділігін анықтау |
2.Ct мәндерінің диапазоны
Ct мәндері 15-35 аралығында.Егер Ct мәні 15-тен төмен болса, күшейту бастапқы кезең диапазонында және флуоресценция шегіне жетпеген деп саналады.Ең дұрысы, Ct мәні мен шаблонның бастапқы көшірме санының логарифмі, яғни стандартты қисық арасында сызықтық байланыс бар.Стандартты қисық арқылы, күшейту тиімділігі 100% болғанда, геннің бір көшірме нөмірін сандық анықтау үшін есептелген Ct мәні 35-ке жуық болады. Егер ол 35-тен көп болса, шаблонның бастапқы көшірме нөмірі теориялық тұрғыдан 1-ден аз, бұл мағынасыз деп санауға болады.
Әртүрлі гендердің Ct диапазондары үшін геннің көшірме санының айырмашылығына және бастапқы үлгі көлеміндегі күшейту тиімділігіне байланысты ген үшін стандартты қисық сызығын жасау және геннің сызықтық анықтау диапазонын есептеу қажет.
3.Ct шамасының әсер етуші факторлары
Күшейту циклдерінің саны мен өнім мөлшері арасындағы қатынастан: күшейтілген өнім мөлшері = бастапқы үлгінің мөлшері × (1+En) цикл нөмірі, идеалды жағдайларда бастапқы үлгінің мөлшері мен En Ct мәніне теріс әсер ететінін көруге болады.Үлгі сапасының немесе күшейту тиімділігінің айырмашылығы Ct мәнінің тым үлкен немесе тым кішкентай болуына әкеледі.
4.Ct мәні тым үлкен немесе тым кішкентай
Жіберу уақыты: 22 ақпан 2023 ж
