qPCR эксперименттерінде праймер дизайны да өте маңызды сілтеме болып табылады.Праймерлер жарамды ма, жоқ па, күшейту тиімділігінің стандартқа жету-жетпеуіне, күшейтілген өнімдердің спецификалық болуына және эксперимент нәтижелерінің қолжетімділігіне тығыз байланысты.
Сонымен, qPCR праймер ерекшелігін қалай жақсартуға болады?Жоғары күшейту тиімділігі?
Бүгін біз сізді qPCR праймерлерін бірге жобалауға алып барамыз және qPCR праймер дизайнын эксперименттерде тиімді тәжірибелік дағдыға айналдырамыз.
qPCR праймерлерін жобалау кезінде әдетте келесі тармақтарға назар аударыңыз: праймерлер мүмкіндігінше интрондар бойынша жобалануы керек, өнімнің ұзындығы 100-300 bp болуы керек, Tm мәні мүмкіндігінше 60°C-қа жақын болуы керек, ал жоғары және төменгі ағынды праймерлер мүмкіндігінше жақын болуы керек, ал праймердің соңы G немесе C болуы керек және т.б.
1. Интрондарды қамтитын праймерлердің дизайны
qPCR праймерлерін жобалау кезінде, интрондар бойынша жобаланған праймерлерді таңдау gDNA үлгісінің күшейтілуіне жол бермейді және өнімдердің барлығы cDNA күшейтуінен алынады, осылайша gDNA ластануының әсерін жояды.
2. Праймер ұзындығы
Праймердің ұзындығы әдетте 18-30 нт аралығында, ал күшейту өнімінің ұзындығын мүмкіндігінше 100-300 б.п. арасында бақылау керек.
Егер праймер тым қысқа болса, ол спецификалық емес күшейтуге әкеледі, ал тым ұзын болса, екіншілік құрылымды оңай құрайды (мысалы, шаш қыстырғыш құрылымы).Егер күшейту өнімі тым ұзын болса, ол полимераза реакциясы үшін жарамсыз, бұл ПТР күшейту тиімділігіне әсер етеді.
3. GC мазмұны және Tm мәні
Праймерлердің GC мазмұны 40% және 60% арасында бақылануы керек.Егер ол тым жоғары немесе тым төмен болса, бұл реакцияны бастауға қолайлы емес.Бірдей Tm мәні мен күйдіру температурасын алу үшін тура және кері праймерлердің GC мазмұны бірдей болуы керек.
Tm мәні мүмкіндігінше 55-65°C аралығында, әдетте 60°C шамасында болуы керек, ал жоғарғы және төменгі ағынның Tm мәні мүмкіндігінше жақын болуы керек, жақсырақ 4°C аспауы керек.
4. Праймердің 3′ ұшында A таңдаудан аулақ болыңыз
Праймердің 3′ ұшы сәйкес келмегенде, әртүрлі негіздердің синтезінің тиімділігінде үлкен айырмашылықтар болады.Соңғы негіз A болғанда, ол сәйкессіздік жағдайында да тізбек синтезін бастай алады және соңғы база T болғанда, сәйкессіздік индукциясының тиімділігі айтарлықтай төмендейді.Сондықтан, праймердің 3′ ұшында А таңдаудан аулақ болуға тырысыңыз, ал Т таңдаған дұрыс.
Егер бұл зонд праймері болса, зондтың 5′ ұшы G болуы мүмкін емес, өйткені FAM флуоресцентті репортер тобына жалғыз G негізі қосылған болса да, G FAM тобы шығаратын флуоресцентті сигналды өшіре алады, нәтижесінде жалған теріс нәтижелер береді.Пайда.
5. Негізгі тарату
Праймердегі төрт негіздің таралуы жақсырақ кездейсоқ, 3′ ұшында 3-тен көп қатарынан G немесе C-ден және 3-тен көп қатарынан аулақ болу керек.G немесе C GC-ке бай реттілік аймағында жұптастыруды жасау оңай.
6. Праймерді жобалау аймағы күрделі қосалқы құрылымдардан аулақ болуы керек.
Күшейту өнімінің бір тізбегінен пайда болған қайталама құрылым ПТР біркелкі өтуіне әсер етеді.Мақсатты реттілікте қайталама құрылымның бар-жоғын алдын ала болжау арқылы, праймерлерді жобалауда бұл аймақты болдырмауға тырысыңыз.
7. Праймерлердің өздері және праймерлердің арасында дәйекті қосымша негіздерден аулақ болуға тырысу керек.
Праймердің өзі мен праймер арасында дәйекті 4 негізді толықтыру болуы мүмкін емес.Праймердің өзінде қосымша дәйектілік болмауы керек, әйтпесе ол шаш қыстырғыш құрылымын қалыптастыру үшін бүктеледі, бұл праймер мен шаблонның күйдіргіш комбинациясына әсер етеді.
Жоғарғы және төменгі ағынды праймерлер арасында қосымша реттілік болуы мүмкін емес.Праймерлер арасындағы қосымша праймер димерлерін шығарады, бұл ПТР тиімділігін төмендетеді және тіпті сандық дәлдікке әсер етеді.Егер праймер-димер және шаш қыстырғыш құрылымдары сөзсіз болса, △G мәні тым жоғары болмауы керек (4,5 ккал/мольден аз болуы керек).
8. Праймерлер мақсатты нақты өнімді күшейтеді.
qPCR анықтаудың түпкі мақсаты - мақсатты геннің көптігін түсіну.Егер спецификалық емес күшейту орын алса, сандық анықтау дұрыс емес болады.Сондықтан, праймерлерді жобалағаннан кейін оларды BLAST арқылы сынау керек, ал өнімдердің ерекшелігі реттілік деректер базасында салыстырылады.
Әрі қарай, qPCR праймерлерін жобалауға мысал ретінде адамның GAS6 (Growth arrest specific 6) генін аламыз.
01 сұрау гені
Homo GAS6NCBI арқылы.Бұл жерде ген атауы мен түрлерін салыстыруға, олардың сәйкестігіне көз жеткізуге назар аудару керек.
02 Ген тізбегін табыңыз
(1) Егер мақсатты тізбек геномдық ДНҚ болса, геннің геномдық ДНҚ тізбегі болып табылатын біріншісін таңдаңыз.
(2) Мақсатты реттілік мРНҚ болса, екіншісін таңдаңыз.Енгізгеннен кейін төмендегі кестедегі «CDS» түймесін басыңыз.Қоңыр фон тізбегі геннің кодтау тізбегі болып табылады.
03 Дизайн праймерлері
Primer-BLAST интерфейсін енгізіңіз
Жоғарғы сол жақта ген реттік нөмірін немесе Fasta пішіміндегі ретті енгізіп, сәйкес параметрлерді толтырыңыз.

«Праймерлерді алу» түймесін басыңыз, сонда NCBI сізге мұндай параметр таңдауы басқа қосу нұсқаларына күшейтілетінін айту үшін ашылады.Біз әртүрлі қосу нұсқаларын тексеріп, сәйкес праймер жұбын алу үшін жібере аламыз (төмендегі суретте көрсетілгендей).Бұл процесті орындау үшін ондаған секунд кетуі мүмкін.
Бұл праймер жұптарының жасыту температурасы шамамен 60 ° C құрайды.Тәжірибе мақсатына сәйкес, орташа ұзындықты, жақсы спецификалық және тәжірибе үшін праймерлердің өзін-өзі толықтыруы аз праймерлерді таңдаңыз, және табыс деңгейі айтарлықтай жоғары!
04Праймер ерекшелігін тексеру
Іс жүзінде, праймерлерді жобалаудан басқа, Primer-Blast біз өзіміз жасаған праймерлерді де бағалай алады.Праймер дизайны бетіне оралыңыз, біз әзірлеген жоғары және төменгі ағынды праймерлерді енгізіңіз және басқа параметрлер реттелмейді.Жібергеннен кейін сіз праймер жұбының басқа гендерде де бар-жоғын көре аласыз.Егер олардың барлығы генде көрсетілсе, біз күшейткіміз келеді , бұл праймер жұбының ерекшелігі керемет екенін көрсетеді!(Мысалы, бұл бастапқы сұраудың жалғыз нәтижесі!)

05 Праймер сапасын бағалау
«Стандартқа дейін күшейту тиімділігін», «күшейтілген өнім сипаттамаларын» және «сенімді эксперимент нәтижелерін» біріктіретін «мінсіз» праймер қандай праймер болып табылады?
Күшейтудің тиімділігі

балқу қисығы
Праймерлердің күшейту тиімділігі 90%-110% жетеді, бұл күшейту тиімділігі жақсы, ал балқу қисығының бір шыңы бар және әдетте Tm>80°C болады, бұл күшейту ерекшелігі жақсы дегенді білдіреді.
 
Қосымша тауарлар:
Нақты уақыттағы ПТР Easy – SYBR GREEN I
Нақты уақыттағы ПТР Easy-Taqman