ПТР реагенттерінің бастапқы сатысында праймерлер мен зондтардың өнімділігін тексеру және ең қолайлы реакция жағдайларын анықтау формальды эксперименттердің бірқалыпты ілгерілеуін қамтамасыз етудің алғышарттары болып табылады.
Сонымен, бастапқы кезеңде праймер зондын қалай растау керек?
Негізгі көрсеткіштер – базалық сызық, күшейту қисығы, ct мәні, күшейту тиімділігі, төмен концентрациядағы үлгіні анықтау, CV және т.б.
Базалық
Негізгі сызық ПТР күшейту қисығындағы көлденең сызық болып табылады.ПТР күшейту реакциясының алғашқы бірнеше циклінде флуоресценция сигналы көп өзгермейді және түзу сызықты құрайды.Бұл түзу сызық негізгі сызық болып табылады.
ПТР праймер зондтарын скрининг кезінде, базалық сызықтың деңгейіне назар аударыңыз.Праймер зондының концентрациясының тазалығы негізгі деңгейге әсер етеді, мысалы, негізгі сызықтың көтерілуіне немесе төмендеуіне әкеледі.Базалық көрсеткіш те өте интуитивті көрсеткіш болып табылады.
Күшейту қисығы
Тағы бір интуитивті көрсеткіш - күшейту қисығының пішіні.Екіншілік күшейтуді немесе басқа қалыпсыз күшейту қисықтарын болдырмау үшін S-тәрізді қисық болған дұрыс.
Ct мәні
Негізгі сызықтан экспоненциалды өсуге дейінгі иілу нүктесіне сәйкес келетін циклдар саны Ct мәні болып табылады.
Бір үлгі үшін әртүрлі праймер зондтары әртүрлі күшейту қисықтарын береді және сәйкес Ct мәніне күшейту тиімділігі мен кедергі дәрежесі әсер етеді.Теориялық тұрғыдан біз таңдаған праймер зондының Ct мәні неғұрлым аз болса, соғұрлым жақсы.
Күшейтудің тиімділігі
ПТР күшейту тиімділігін бағалаудың ең сенімді және тұрақты әдістерінің бірі стандартты қисық болып табылады, оны зерттеушілер де кеңінен мойындайды.Әдіс мақсатты үлгілердің салыстырмалы санын бақылау үшін үлгілер қатарын жасауды қамтиды.Бұл үлгілер әдетте концентрлі ерітінділердің сериялық сұйылтулары арқылы жасалады, ең жиі қолданылатыны 10 еселік сұйылту болып табылады.Сұйылтылған үлгілердің сериясын пайдаланып, Cq мәнін алу үшін күшейту үшін стандартты qPCR бағдарламасын пайдаланып, соңында Cq= -klgX0+b сызықтық теңдеуін және E=10(-1 /k)-1 күшейту тиімділігін алу үшін әрбір үлгінің концентрациясына және сәйкес Cq мәніне сәйкес стандартты қисық сызыңыз.Сандық талдау үшін qPCR пайдаланған кезде күшейту тиімділігі 90%-110% (3,6>k>3,1) диапазонында болуы талап етіледі.
Төмен концентрациялы үлгілерді анықтау
Үлгі концентрациясы төмен болған кезде әртүрлі праймер зондтарының анықтау жылдамдығы әртүрлі болады.Біз репликациялау үшін төмен концентрациялы 20 үлгіні таңдаймыз және анықтау жылдамдығы ең жоғары праймер-зонд жүйесі ең жақсы болып табылады.
Вариация коэффициенті (CV)
Нуклеин қышқылының күшейтілуін анықтауға арналған реагенттің желілік стандартына сәйкес 10 қайталанатын үлгіні әртүрлі праймер зондтары арқылы анықтауға болады.
Сандық реагенттер:
Дәлдік
Бір партиядағы дәлдік сәйкес болуы керек: сынақ концентрациясының логарифмдік мәнінің өзгеру коэффициенті (CV,%) ≤5%.Үлгі концентрациясы төмен болғанда анықтау концентрациясы логарифмінің вариация коэффициенті (CV,%) ≤10%
Сапалы реагенттер:
Дәлдік
Бір топтамадағы дәлдік мыналарға сәйкес келуі керек:
(1) Ct мәнінің өзгеру коэффициенті (CV,%) ≤5%
Бір үлгі параллельді түрде 10 рет сыналады және сынақ нәтижелері сәйкес болуы керек
Жіберу уақыты: 18 қыркүйек 2021 ж
