Індеттің бастапқы кезеңінде, қарқынды дамуына байланысты, күдікті науқастарды жылдам диагностикалау COVID-19 алдын алудың кілті болып табылады.Кейбір мақұлданған нуклеин қышқылын анықтау реагенттерінің әзірлеу уақыты қысқа және өнімділікті асығыс растау, реагентті оңтайландырудың жеткіліксіздігі және партиялар арасындағы үлкен айырмашылықтар сияқты мәселелер бар;Нуклеин қышқылын анықтау процесінің әртүрлі аспектілеріндегі әртүрлі клиникалық зертханалардың мәселелері де нуклеин қышқылын анықтау нәтижелерінің дәлдігіне әсер етуі мүмкін.Бұл мақала ағымдағы SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтаудағы негізгі сілтемелер мен нүктелерге назар аударады және нуклеин қышқылын зертханалық анықтауды және клиникалық сәйкессіздікті жалған теріс және оң қайта тексеру мәселелерін талдайды.

SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтау принциптері

SARS-CoV-2 – геномдық реттілігі шамамен 29 кб, 10 гені бар, 10 ақуызды тиімді кодтай алатын РНҚ вирусы.Вирустар РНҚ мен ақуыздан тұрады, ал ең сыртқы қабаты липидтер мен гликопротеидтерден тұратын сыртқы жабын болып табылады.Ішінде белок капсид РНҚ-ны орап, осылайша оңай ыдырайтын РНҚ-ны (Р1) қорғайды.

P1 SARS-COV-2 құрылымы

Вирустар инфекцияны тудыру үшін арнайы жасуша бетіндегі рецепторлар арқылы жасушаларға енеді және репликация үшін хост жасушаларын пайдаланады.

Вирустық нуклеин қышқылын анықтау принципі вирустық РНҚ-ны жасуша лизаты арқылы экспозициялау, содан кейін анықтау үшін нақты уақыттағы флуоресцентті кері транскрипция-полимеразды тізбекті реакцияны (RT-PCR) пайдалану болып табылады.

Анықтау принципінің кілті нуклеин қышқылдарының тізбегінің «мақсатты сәйкестігіне» қол жеткізу үшін праймерлер мен зондтарды пайдалану болып табылады, яғни шамамен 30 000 негізде басқа вирустардан ерекшеленетін SARS-CoV-2 нуклеин қышқылының тізбегін табу (нуклеин қышқылының басқа вирустарға ұқсастығы) «Төмен» аймақ), конструкторлар.

Праймерлер мен зондтар SARS-CoV-2 нуклеин қышқылының белгілі бір аймағына жоғары сәйкес келеді, яғни ерекшелігі өте күшті.Тексерілетін үлгінің нақты уақыттағы флуоресцентті RT-PCR күшейту нәтижесі оң болса, бұл үлгіде SARS-CoV-2 бар екенін дәлелдейді.P2 қараңыз.

SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтаудың P2 қадамдары (нақты уақыттағы флуоресцентті RT-ПТР)

SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтауға арналған зертхананың шарттары мен талаптары

Нуклеин қышқылын сынау зертханалары теріс қысымды орталар үшін ең қолайлы болып табылады және олар қысымды бақылауға, ауа ағынын сақтауға және аэрозольдерді жоюға назар аударуы керек.Нуклеин қышқылын сынайтын қызметкерлердің тиісті біліктілігі болуы, полимеразды тізбекті реакция бойынша тиісті дайындықтан өтуі және бағалаудан өтуі керек.Зертхананы қатаң басқару керек, орнын аймақтарға бөлу керек және қатысы жоқ қызметкерлерге кіруге қатаң тыйым салынады.Таза аумақты желдетіп, дезинфекциялау керек.Тиісті заттар аймақтарға орналастырылады, таза және лас бөлінеді, уақытында ауыстырылады және орнында залалсыздандырылады.Кәдімгі дезинфекция: үлкен аумақтар үшін хлоры бар дезинфекциялаушы негізгі шешім болып табылады, ал шағын аумақтар үшін 75% спиртті қолдануға болады.Аэрозольмен күресудің жақсы тәсілі - желдету үшін терезелерді ашу, ауаны дезинфекциялау ультракүлгін сәулелер, сүзу және ауаны дезинфекциялау арқылы да жүзеге асырылуы мүмкін.

SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтаудың негізгі сілтемелері мен параметрлері (нақты уақыттағы флуоресцентті RT-PCR)

Зертханалар әдетте нуклеин қышқылын «анықтауға» көп көңіл бөлсе де, шын мәнінде, нуклеин қышқылын «экстракциялау» да вирус үлгілерін жинау және сақтаумен тығыз байланысты табысты анықтаудың негізгі қадамдарының бірі болып табылады.

Қазіргі уақытта мұрын-жұтқыншақ жағындылары сияқты кең таралған тыныс алу үлгілері екінші әдісті қолданады, бұл нуклеин қышқылының экстракциясы және лизис ерітіндісі негізінде дайындалған инактивация (консервация) ерітіндісі.Бір жағынан, бұл вирусты сақтау ерітіндісі вирустың ақуызын денатурациялауы мүмкін, оның белсенділігін жоғалтады және енді жұқпалы болмайды, тасымалдау және анықтау сатысының қауіпсіздігін жақсартады;екінші жағынан, ол нуклеин қышқылын босату, нуклеин қышқылын ыдырататын ферментті жою және вирустың алдын алу үшін вирусты тікелей жарып жібере алады.РНҚ бұзылады.

Нуклеин қышқылының экстракциялық лизисі ерітіндісі негізінде дайындалған вирус сынамаларын алу ерітіндісі.Негізгі құрамдастарға теңдестірілген тұздар, этилендиаминтетрасірке қышқылының хелатизаторы, гуанидин тұзы (гуанидин-изотиоцианат, гуанидин гидрохлориді және т.б.), анионды беттік белсенді зат (додекан) натрий сульфаты), катионды беттік белсенді зат (тетрадецил триметоксалаты, аммониотоксиди-8 гидридоксидриол), итол, протеиназа K және басқа бірнеше немесе одан да көп компоненттер.Қазіргі уақытта нуклеин қышқылын экстракциялау жинақтарының көптеген түрлері бар және әртүрлі нуклеин қышқылын алу және тазарту реагенттері қолданылады.Нуклеин қышқылын экстракциялау және тазарту үшін бірдей реагент пайдаланылса да, әрбір жинақтың экстракция процедуралары әртүрлі.

Қазіргі уақытта Ұлттық медициналық өнімдер әкімшілігі бекіткен нуклеин қышқылын анықтау жинағы өнімдері SARS-CoV-2 геномындағы ORF1ab, E және N гендерінің негізінде таңдалады.Әртүрлі өнімдерді анықтау принциптері негізінен бірдей, бірақ олардың праймерлері мен зонд конструкциялары әртүрлі.Бір мақсатты сегменттер (ORF1ab), қос мақсатты сегменттер (ORF1ab, N немесе E) және үш мақсатты сегменттер (ORF1ab, N және E) бар.Анықтау және интерпретациялау, нуклеин қышқылын экстракциялау және нақты уақыттағы флуоресцентті RT-ПТР реакция жүйесі арасындағы айырмашылық тиісті жинақ нұсқауларына сілтеме жасау керек және пайдаланушыларға интерпретацияға арналған жинақ нұсқауларында көрсетілген интерпретация әдісін қатаң сақтау ұсынылады.Нақты уақыттағы флуоресцентті RT-ПТР арқылы күшейтілген жалпы аймақтар, праймерлер және зонд тізбегі P3 ішінде көрсетілген.

P3 SARS-CoV-2 ампликон нысанасының геномдағы орналасуы және праймерлер мен зондтардың тізбегі

SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтау нәтижелерін интерпретациялау (Rеал-Tфлуоресцентті RT-ПТР)

«SARS-CoV-2 инфекциясы үшін пневмонияның алдын алу және бақылау жоспары (Екінші басылым)» бірінші рет бір генді күшейту нәтижелерін бағалау критерийлерін нақтылады:

1. Ct немесе Ct≥40 теріс емес;

2. Ct<37 оң;

3. 37-40 Ct мәні сұр түсті аймақ болып табылады.Тәжірибені қайталау ұсынылады.Егер Ct<40 және күшейту қисығын қайталау нәтижесі айқын шыңдарға ие болса, үлгі оң деп бағаланады, әйтпесе теріс болады».

Нұсқаулықтың үшінші басылымы және нұсқаулықтың төртінші басылымы жоғарыдағы критерийлерді жалғастырды.Дегенмен, коммерциялық жинақтарда қолданылатын әртүрлі мақсаттарға байланысты нұсқаулықтың жоғарыда аталған 3-ші басылымында өндіруші ұсынған нұсқаулар басым болатынын баса көрсете отырып, мақсаттардың комбинациясын анықтау критерийлері берілмеді.Әдістемелік нұсқаулардың бесінші басылымынан бастап екі мақсат, әсіресе бағалау қиын бір нысанаға қатысты пайымдау критерийлері нақтыланды.Яғни, зертхана SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтау үшін жағдайдың оң екенін растағысы келсе, келесі 2 шарттың 1-ін орындау қажет:

(1) Бір үлгідегі SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) екі нысанасы нақты уақыттағы флуоресцентті RT-ПТР арқылы оң сыналады.Егер бір мақсат оң болса, қайта сынама алу және қайта сынау қажет.Сынақ нәтижелері болса Жалғыз нысана әлі оң болса, ол оң деп бағаланады.

(2) Нақты уақыттағы флуоресцентті RT-ПТР екі үлгісі бір уақытта бір мақсатты оңды көрсетті немесе бір түрдегі екі үлгі оң деп бағалауға болатын бір мақсатты оң сынақ нәтижесін көрсетті.Дегенмен, нұсқаулықта нуклеин қышқылын сынаудың теріс нәтижелері SARS-CoV-2 инфекциясын жоққа шығара алмайтынын атап көрсетеді.Жалған негативтерді тудыруы мүмкін факторларды, соның ішінде нашар үлгі сапасы (орофаринс пен басқа бөліктерден алынған тыныс алу үлгілері), сынамаларды тым ерте немесе тым кеш жинау, үлгілер дұрыс сақталмаған, тасымалданбаған және өңделмеген және технологияның өзінде проблемалар болған (вирустың өзгеруі, ПТР тежелуі) және т.б.

SARS-CoV-2 анықтауындағы жалған негативтердің себептері

Қазіргі уақытта өзекті болып отырған нуклеин қышқылын сынаудағы «жалған теріс» ұғымы көбінесе нуклеин қышқылын сынау нәтижелері клиникалық көріністерге сәйкес келмейтін «жалған теріс» дегенді білдіреді, яғни клиникалық симптомдар мен бейнелеу нәтижелері COVID-19-ға өте күдік туғызады, бірақ нуклеин қышқылы сынақтары әрқашан «теріс» болып табылады.Ұлттық денсаулық сақтау комиссиясының Клиникалық зертханалық орталығы SARS-CoV-2 «жалған теріс» сынамасын түсіндірді.

(1) Жұқтырған адамның жасушаларында вирустың белгілі бір мөлшері бар.Қолданыстағы деректер денеге вирус жұқтырғаннан кейін, вирус мұрын және ауыз арқылы жұлдыруға, содан кейін трахеяға және бронхтарға түседі, содан кейін альвеолаларға жетеді.Жұқтырған адам инкубациялық кезеңді, жеңіл белгілерді, содан кейін ауыр белгілер процесін және аурудың әртүрлі кезеңдерін бастан кешіреді.Ал дененің әртүрлі бөліктерінде болатын вирустың мөлшері әртүрлі.

Жасуша түрлерінің вирустық жүктемесі бойынша альвеолярлы эпителий жасушалары (төменгі тыныс жолдары)> тыныс жолдарының эпителий жасушалары (жоғарғы тыныс жолдары)> фибробласттар, эндотелий жасушалары және макрофагтар және т.б.;үлгі түрінен альвеолярлы шаю сұйықтығы (ең жақсы)>терең жөтел қақырығы>мұрын-жұтқыншақ жағынды>орофарингеальді жағынды>қан.Сонымен қатар, вирусты нәжістен де анықтауға болады.Дегенмен, операцияның ыңғайлылығын және пациенттерді қабылдауды ескере отырып, жиі қолданылатын клиникалық үлгі тәртібі - ауыз-жұтқыншақ жағынды> мұрын-жұтқыншақ жағынды> бронхты шаю сұйықтығы (күрделі операция) және терең қақырық (әдетте құрғақ жөтел, алу қиын) .

Сондықтан кейбір науқастардың ауыз-жұтқыншақ немесе мұрын-жұтқыншақ жасушаларында вирустың мөлшері аз немесе өте төмен.Тексеру үшін ауыз-жұтқыншақтың немесе мұрын-жұтқыншақтың үлгілері ғана алынса, вирустық нуклеин қышқылы анықталмайды.

(2) Сынаманы жинау кезінде құрамында вирусы бар жасушалар жиналмады немесе вирустық нуклеин қышқылы тиімді сақталмады.

[① Дұрыс емес жинау орны, мысалы, ауыз-жұтқыншақ жағындыларын жинау кезінде жинау тереңдігі жеткіліксіз, жиналған мұрын-жұтқыншақ жағындылары мұрын қуысында терең жиналмайды және т.б. Жиналған жасушалардың көпшілігі вируссыз жасушалар болуы мүмкін;

②Үлгі алу жағындылары дұрыс пайдаланылмайды.Мысалы, PE талшығы, полиэфир талшығы және полипропилен талшығы сияқты синтетикалық талшықтар жағынды басының материалы үшін ұсынылады.Мақта сияқты табиғи талшықтар нақты жұмыста қолданылады (белоктың күшті адсорбциясы және жуылуы оңай емес) және нейлон талшықтары (судың нашар сіңірілуі, сынама алу көлемінің жеткіліксіздігіне әкеледі);

③Нуклеин қышқылдарын (ДНҚ/РНҚ) оңай сіңіретін полипропиленді немесе полиэтиленді сақтау түтіктерін дұрыс пайдаланбау сияқты вирустарды сақтайтын түтіктерді дұрыс пайдаланбау, бұл сақтау ерітіндісіндегі нуклеин қышқылының концентрациясының төмендеуіне әкеледі.Практикада вирустық нуклеин қышқылдарын сақтау үшін полиэтилен-пропиленді полимерлі пластикті және кейбір арнайы өңделген полипропилен пластикалық ыдыстарды пайдалану ұсынылады.]

[① Дұрыс емес жинау орны, мысалы, ауыз-жұтқыншақ жағындыларын жинау кезінде жинау тереңдігі жеткіліксіз, жиналған мұрын-жұтқыншақ жағындылары мұрын қуысында терең жиналмайды және т.б. Жиналған жасушалардың көпшілігі вируссыз жасушалар болуы мүмкін;

②Үлгі алу жағындылары дұрыс пайдаланылмайды.Мысалы, PE талшығы, полиэфир талшығы және полипропилен талшығы сияқты синтетикалық талшықтар жағынды басының материалы үшін ұсынылады.Мақта сияқты табиғи талшықтар нақты жұмыста қолданылады (белоктың күшті адсорбциясы және жуылуы оңай емес) және нейлон талшықтары (судың нашар сіңірілуі, сынама алу көлемінің жеткіліксіздігіне әкеледі);

③Нуклеин қышқылдарын (ДНҚ/РНҚ) оңай сіңіретін полипропиленді немесе полиэтиленді сақтау түтіктерін дұрыс пайдаланбау сияқты вирустарды сақтайтын түтіктерді дұрыс пайдаланбау, бұл сақтау ерітіндісіндегі нуклеин қышқылының концентрациясының төмендеуіне әкеледі.Практикада вирустық нуклеин қышқылдарын сақтау үшін полиэтилен-пропиленді полимерлі пластикті және кейбір арнайы өңделген полипропилен пластикалық ыдыстарды пайдалану ұсынылады.]

(4) Клиникалық зертханалық операция стандартталмаған.Үлгіні тасымалдау және сақтау шарттары, клиникалық зертханалардың стандартталған жұмысы, нәтижелерді интерпретациялау және сапаны бақылау сынақ нәтижелерінің дәлдігі мен сенімділігін қамтамасыз ететін негізгі факторлар болып табылады.Ұлттық денсаулық сақтау комиссиясының Клиникалық зертханалық орталығы 2020 жылғы 16-24 наурызда өткізген сыртқы сапаны бағалау нәтижелері бойынша жарамды нәтиже алған 844 зертхананың 701-і (83,1%) біліктілік санатына, 143-і (16,9%) сәйкес келмеді.Білікті, жалпы зертханалық сынақ жағдайлары жақсы, бірақ әртүрлі зертханаларда әлі де персоналдың жұмыс істеу қабілетінде, бір мақсатты оң үлгіні интерпретациялау қабілетінде және сапаны бақылауда айырмашылықтар бар.

SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтаудың жалған терісін қалай азайтуға болады?

Нуклеин қышқылын анықтауда жалған теріс мәндерді азайту жалған негативтерді шығарудың төрт аспектілерінен оңтайландырылған болуы керек.

(1) Жұқтырған адамның жасушаларында вирустың белгілі бір мөлшері бар.Вирус жұқтырған күдікті адамдардың денесінің әртүрлі бөліктеріндегі вирустың концентрациясы әр уақытта әртүрлі болады.Егер жұтқыншақ болмаса, ол бронхты шаю сұйықтығында немесе нәжісте болуы мүмкін.Сынақ үшін бір уақытта немесе аурудың дамуының әртүрлі кезеңдерінде үлгілердің бірнеше түрін жинауға болатын болса, бұл жалған теріс нәтижелерді болдырмауға көмектеседі.

(2) Құрамында вирусы бар жасушалар үлгіні алу кезінде жиналуы керек.Бұл мәселені сынама жинаушылардың дайындығын күшейту арқылы шешуге болады.

(3) Сенімді IVD реагенттері.Ұлттық деңгейде реагенттерді анықтау тиімділігін бағалау бойынша зерттеулер жүргізу және бар проблемаларды талқылау арқылы реагенттерді анықтау тиімділігін одан әрі жақсартуға және талдаудың сезімталдығын арттыруға болады.

(4) Клиникалық зертханалардың стандартталған жұмысы.Зертханалық қызметкерлерді оқытуды күшейту, зертханалық сапа менеджменті жүйесін үздіксіз жетілдіру, негізделген бөлуді қамтамасыз ету және персоналдың анықтау қабілетін арттыру арқылы зертханалық операцияларды дұрыс орындамау салдарынан жалған негативтерді азайтуға болады.

Сауыққан және шығарылған науқастарда SARS-CoV-2 нуклеин қышқылы сынағының қайта оң нәтиже беру себептері

«COVID-19 диагностикасы мен емдеу жоспары (сынақ жетінші шығарылымы)» COVID-19 пациенттерінің емделіп, ауруханадан шығарылуының критерийлерінің бірі қатарынан екі тыныс алу жолдарының сынамаларында нуклеин қышқылы сынамасы теріс болуы (кемінде 24 сағат аралығы), бірақ нуклеиндік қышқылды сынаудың өте аз болуы, бірақ SARS2 сынамасының әсерінен нуклеинді қышқылдың әртүрлі сынамалары қайта шығарылған пациенттер өте аз екені анық көрсетілген. себептері.

(1) SARS-CoV-2 – жаңа вирус.Оның патогендік механизмін, туындаған аурудың толық бейнесін және аурудың ағымының сипаттамаларын одан әрі түсіну қажет.Сондықтан, бір жағынан шығарылған науқастарды бақылауды күшейтіп, 14 күндік медициналық бақылау жүргізу қажет.Аурудың пайда болуының, дамуының және нәтижесінің бүкіл процесін түсінуді тереңдету үшін бақылауды, денсаулықты бақылауды және денсаулық жағдайын бақылауды жүзеге асырыңыз.

(2) Науқас қайтадан вирус жұқтыруы мүмкін.Академик Чжун Наншан былай деді: «Емделген науқастарда антиденелер болғандықтан, SARS-CoV-2 қайтадан енген кезде антиденелер арқылы жойылуы мүмкін.Көптеген себептер бар, олар сауығып кеткен науқастың себебі болуы мүмкін немесе ол вирустың мутациясына байланысты болуы мүмкін, тіпті зертханалық тексерудің себебі болуы мүмкін.Егер бұл вирустың өзі болса, SARS-CoV-2 мутациясы қалпына келтірілген пациент шығарған антидененің мутацияланған вирусқа қарсы тиімсіз болуына әкелуі мүмкін.Егер пациент мутацияланған вирусты қайтадан жұқтырса, нуклеин қышқылының сынағы қайтадан оң болуы мүмкін.

(3) Зертханалық сынақ әдістеріне келетін болсақ, әрбір сынау әдісінің өз шектеулері бар.SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтау ген тізбегін таңдауға, реагенттердің құрамына, әдістің сезімталдығына және басқа себептерге байланысты, бұл қолданыстағы жинақтардың өздерінің төменгі анықтау шегіне ие болуына әкеледі.Науқас емделгеннен кейін ағзадағы вирус азаяды.Тексерілетін үлгідегі вирустық жүктеме анықтаудың төменгі шегінен төмен болғанда, «теріс» нәтиже пайда болады.Бірақ бұл нәтиже ағзадағы вирустың толығымен жойылғанын білдірмейді.Вирус емдеуді тоқтатқаннан кейін болуы мүмкін.Қайта тірілу», көшіруді жалғастырыңыз.Сондықтан, шығарылғаннан кейін 2-4 апта ішінде аптасына бір рет қарау ұсынылады.

(4) Нуклеин қышқылы вирустың генетикалық материалы болып табылады.Науқас вирусқа қарсы емнен өткеннен кейін вирус жойылады, бірақ қалған вирустық РНҚ фрагменттері әлі де адам ағзасында сақталады және денеден толығымен шығарылмайды.Кейде, белгілі бір жағдайларда, ол көбірек сақталуы мүмкін.Ұзақ уақыт және осы уақытта нуклеин қышқылының сынағы «өтпелі» оң болады.Науқастың қалпына келу уақытының ұзаруымен организмдегі қалдық РНҚ фрагменттері бірте-бірте таусылғаннан кейін нуклеин қышқылы сынағының нәтижесі теріс болуы мүмкін.

(5) SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын сынау нәтижесі тек вирустық РНҚ бар немесе жоқтығын дәлелдейді және вирустың белсенділігін және вирустың берілу мүмкіндігін дәлелдей алмайды.Нуклеин қышқылы сынамасы қайтадан оң болған науқас қайтадан инфекция ошағына айнала ма, жоқ па, соны дәлелдеу қажет.Клиникалық үлгілерде вирустық культураны жүргізу және оның жұқпалы екенін дәлелдеу үшін «тірі» вирусты өсіру қажет.

Түйіндеме

Қорытындылай келе, SARS-CoV-2 нуклеин қышқылы сынағының жалған теріс көрсеткіштерін, қайта сынау позитивтерін және клиникалық көріністерге сәйкес келмейтін басқа жағдайларды толығымен болдырмауға болмайды.Нақты скрининг пен тестілеуде өткізіп алған диагнозды және қате диагнозды болдырмау үшін кешенді диагностика үшін клиникалық симптомдарды, бейнелеу емтихандарын (КТ) және эксперименттерді біріктіру ұсынылады.Сынақ нәтижелерінің клиникалық көріністерге анық сәйкес келмейтіні анықталса, SARS-CoV-2 вирусының ерте инфекциясын, қайталанатын инфекцияны немесе басқа респираторлық вирустық инфекциялармен біріктірілген және т.б. мүмкіндігін болдырмау үшін бүкіл сынақ сілтемесін (үлгілерді жинау, айналым және өңдеу сілтемелері) кешенді талдауды жүргізу ұсынылады.Жағдайлар рұқсат етсе, қайта зерттеу үшін қақырық немесе альвеолярлы шаю сұйықтығы сияқты сезімталырақ үлгілерді жинау ұсынылады.

Қосымша тауарлар:

SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтау жинағы (Мультиплексті ПТР флуоресцентті зонд әдісі)