Бастапқы материал: РНҚ

Сандық кері транскрипциялық ПТР (RT-qPCR) – бастапқы материал ретінде РНҚ пайдаланатын ПТР эксперименттерінде қолданылатын тәжірибелік әдіс.Бұл әдісте жалпы РНҚ немесе хабаршы РНҚ (мРНҚ) алдымен кері транскриптаза арқылы комплементарлы ДНҚ-ға (cDNA) транскрипцияланады.Кейіннен үлгі ретінде cDNA көмегімен qPCR реакциясы орындалды.RT-qPCR әртүрлі молекулярлық биология қолданбаларында, соның ішінде ген экспрессиясын талдау, РНҚ интерференциясын валидациялау, микромассив валидациясы, патогенді анықтау, генетикалық тестілеу және ауруды зерттеуде қолданылған.

RT-qPCR үшін бір қадамды және екі қадамды әдістер

RT-qPCR бір қадамды немесе екі қадамды әдіспен орындалуы мүмкін.Бір сатылы RT-qPCR кері транскрипция мен ПТР күшейтуді біріктіреді, бұл кері транскриптаза мен ДНҚ полимеразаға бірдей буфер жағдайында бір түтіктегі реакцияны аяқтауға мүмкіндік береді.Бір қадамды RT-qPCR тек реттілікке тән праймерлерді пайдалануды талап етеді.Екі сатылы RT-qPCR-де кері транскрипция және ПТР күшейту әртүрлі оңтайландырылған буферлерді, реакция жағдайларын және праймерді жобалау стратегияларын пайдалана отырып, екі түтікте орындалады.

1-бап

 

Артықшылық

Кемшілігі

Бір қадам Бұл әдістің эксперименттік қателігі аз, өйткені екі реакция да бір түтікте орындалады

 

Тамшуырлау қадамдарының аз болуы ластану қаупін азайтады

 

Жоғары өнімді күшейту/скрининг үшін қолайлы, жылдам және қайталанатын

Екі сатылы реакцияларды бөлек оңтайландыру мүмкін емес

 

Екі сатылы реакцияны біріктіру арқылы реакция шарттары бұзылғандықтан, сезімталдық екі сатылы әдіс сияқты жақсы емес.

 

Бір іріктеу арқылы анықталған нысаналардың саны аз

Екі қадам Ұзақ уақыт бойы сақталуы мүмкін және бірнеше реакцияларда қолданылатын тұрақты cDNA кітапханаларын жасау мүмкіндігі

 

Мақсатты гендер мен анықтамалық гендерді бір кДНҚ кітапханасынан бірнеше кДНҚ кітапханаларын қажет етпей күшейтуге болады.

 

Реакция буферлері және бір реакциялық жүрістерді оңтайландыруға мүмкіндік беретін реакция шарттары

 

Триггер шарттарын икемді таңдау

Бірнеше түтіктерді пайдалану және көбірек тамшуырлау қадамдары ДНҚ-ның ластану қаупін арттырады,

және уақытты қажет етеді.

 

Бір қадамдық әдіске қарағанда көбірек оңтайландыруды қажет етеді

Қосымша тауарлар:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Бір қадам)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Бір қадам)-Тақман

RT Easyᵀᴹ Бірінші тізбекті CDNA синтезіне арналған негізгі премикс

Нақты уақыттағы ПТР Easyᵀᴹ-SYBR Green I жинағы

Нақты уақыттағы ПТР Easyᵀᴹ-Taqman

Жалпы РНҚ және мРНҚ таңдауы

RT-qPCR тәжірибесін құрастырған кезде, кері транскрипция үшін үлгі ретінде жалпы РНҚ немесе тазартылған мРНҚ пайдалану керектігін шешу маңызды.мРНҚ сәл жоғары сезімталдықты қамтамасыз ете алатынына қарамастан, жалпы РНҚ әлі де жиі қолданылады.Мұның себебі, жалпы РНҚ мРНҚ-ға қарағанда бастапқы материал ретінде маңыздырақ артықшылығы бар.Біріншіден, процесс азырақ тазарту қадамдарын талап етеді, бұл үлгіні жақсырақ сандық қалпына келтіруді және нәтижелерді бастапқы ұяшық нөмірлеріне жақсы қалыпқа келтіруді қамтамасыз етеді.Екіншіден, ол мРНҚ-ны байыту қадамын болдырмайды, бұл әртүрлі мРНҚ-лардың әртүрлі қалпына келуіне байланысты бұрмаланған нәтижелер мүмкіндігін болдырмайды.Тұтастай алғанда, қосымшалардың көпшілігінде мақсатты геннің салыстырмалы сандық көрсеткіші анықтаудың абсолютті сезімталдығынан маңыздырақ болғандықтан, жалпы РНҚ көп жағдайда қолайлырақ.

Кері транскрипциялық праймер

Екі сатылы әдісте cDNA реакциясын толтыру үшін үш түрлі әдісті қолдануға болады: олиго(dT) праймерлер, кездейсоқ праймерлер немесе реттілікке тән праймерлер.Әдетте, олиго(dT) праймерлер мен кездейсоқ праймерлер комбинацияда қолданылады.Бұл праймерлер шаблондық мРНҚ тізбегіне қосылып, синтездің бастапқы нүктесі бар кері транскриптазаны қамтамасыз етеді.

2-бап

Праймер таңдау Құрылымы және қызметі Артықшылық Кемшілігі
Олиго(dT) праймер (немесе анкерлік олиго(dT) праймер) мРНҚ поли(А) құйрығындағы тимин қалдықтарына ұзартылған күйдіру;анкерлік олиго(dT) праймерінің 3′ ұшында G, C немесе A бар (зәкір орны) Поли(А) құйрықты мРНҚ-дан толық ұзындықты кДНҚ синтезі

 

Бастапқы материал аз болған кезде қолданылады

 

Бекіту орны олиго(dT) праймерінің мРНҚ-ның 5′ поли(А) құйрығымен байланысуын қамтамасыз етеді.

Поли(A) құйрықтары бар гендерді күшейту үшін ғана жарамды

 

Поли(А)дағы бастапқы тораптан*2 кесілген cDNA алыңыз

 

3′ ұшына байланыстырылған*

 

*Біріктірілген олиго(dT) праймерлері пайдаланылса, бұл мүмкіндік азайтылады

кездейсоқ праймер

 

Ұзындығы 6-9 негіз, олар РНҚ транскрипциясы кезінде бірнеше учаскелерге қосыла алады Барлық РНҚ-ға (тРНҚ, рРНҚ және мРНҚ) байланысты.

 

Маңызды қайталама құрылымы бар транскрипттерге немесе бастапқы материал аз болған кезде қолайлы

 

Жоғары cDNA шығымдылығы

cDNA барлық РНҚ-дан кері транскрипцияланады, ол әдетте қажет емес және мақсатты мРНҚ сигналын сұйылтуы мүмкін.

 

кесілген кДНҚ алыңыз

реттілікке тән праймерлер Арнайы мРНҚ тізбегіне бағытталған пайдаланушы праймерлер арнайы cDNA кітапханасы

 

Сезімталдықты жақсарту

 

Кері qPCR праймерлерін пайдалану

Тек бір мақсатты геннің синтезімен шектеледі

Кері транскриптаза

Кері транскриптаза – ДНҚ синтездеу үшін РНҚ қолданатын фермент.Кейбір кері транскриптазалар РНҚ белсенділігіне ие және транскрипциядан кейін РНҚ-ДНҚ гибридті тізбектеріндегі РНҚ жіптерін ыдыратуы мүмкін.Егер оның RNase ферментативті белсенділігі болмаса, qPCR тиімділігін арттыру үшін RNaseH қосуға болады.Жиі қолданылатын ферменттерге Moloney тышқан лейкозы вирусының кері транскриптазасы және құс миелобластома вирусының кері транскриптазасы жатады.RT-qPCR үшін термотұрақтылығы жоғары кері транскриптазаны таңдау өте қолайлы, осылайша кДНҚ синтезі жоғары температурада орындалады, бұл жоғары екіншілік құрылымы бар РНҚ-ның сәтті транскрипциясын қамтамасыз етеді, сонымен бірге олардың бүкіл реакция бойына толық белсенділігін сақтайды, нәтижесінде жоғарырақ болады. кДНҚ береді.

Қосымша тауарлар:

Болжалды M-MLV кері транскриптаза

Кері транскриптазаның RNase H белсенділігі

RNaseH қос тізбекті ДНҚ-ның тиімді синтезіне мүмкіндік беретін РНҚ-ДНҚ дуплекстерінен РНҚ тізбектерін ыдыратуға қабілетті.Дегенмен, үлгі ретінде ұзын мРНҚ пайдаланған кезде, РНҚ мерзімінен бұрын ыдырауы мүмкін, нәтижесінде кДНҚ кесіледі.Сондықтан, егер ұзақ транскрипттердің синтезі қажет болса, cDNA клондау кезінде RNaseH белсенділігін азайту жиі тиімді.Керісінше, RNase H белсенділігі бар кері транскриптазалар qPCR қолданбалары үшін жиі пайдалы, өйткені олар ПТР бірінші циклі кезінде РНҚ-ДНҚ дуплекстерінің балқуын күшейтеді.

Праймер дизайны

RT-qPCR-де qPCR қадамы үшін пайдаланылатын ПТР праймерлері экзон-эксондық түйінді қамту үшін ең дұрысы жобалануы керек, мұнда күшейту праймері нақты экзон-интрон шекарасын қамтуы мүмкін.Құрамында интрон бар геномдық ДНҚ тізбегі күшейтілмегендіктен, бұл дизайн геномдық ДНҚ-ны ластаудан күшейтілген жалған позитивтердің пайда болу қаупін азайтады.

Егер праймерлер экзондарды немесе экзон-эксон шекараларын бөлуге арналған болмаса, геномдық ДНҚ ластануын жою үшін РНҚ үлгілерін RNase жоқ DNase I немесе dsDNase көмегімен өңдеу қажет болуы мүмкін.

RT-qPCR басқару

Кері транскрипцияның теріс бақылауы (-RT бақылау) ДНҚ ластануын (мысалы, алдыңғы реакциялардың геномдық ДНҚ немесе ПТР өнімдері) анықтау үшін барлық RT-qPCR эксперименттеріне қосылуы керек.Бұл бақылауда кері транскриптазадан басқа барлық реакция компоненттері бар.Бұл бақылаумен кері транскрипция орын алмайтындықтан, ПТР күшейту байқалса, ДНҚ-дан ластану ықтималдығы жоғары.


Жіберу уақыты: 02 тамыз 2022 ж