Желімді қалпына келтіруді жақсарту бойынша кеңестер

1. Электрофорез кезінде үлгі жүктемесін арттыру.

2. Жаңадан дайындалған электрофорез буферін пайдаланыңыз.

3. Желімді кесу кезінде желімді кесу көлемін азайту үшін тек жолақтары бар желімді кесуге тырысыңыз: бірнеше мақсатты фрагменттері бар желім қажет емес, әйтпесе бұл қалпына келтіру жылдамдығына әсер етеді.

4. Екі немесе одан да көп желімді еріткеннен кейін, көлемі қаншалықты үлкен болса да, түтікшені қолданыңыз және оны сол бағанға ауыстырыңыз.

5. Зольге қосылған ерітінді сәл артық болуы мүмкін, бұл ДНҚ-ның мембранамен байланысуына қолайлырақ, бірақ жалпы алғанда 750ul аспайды.

6. Гельді қалпына келтірудің кілті - колоннадағы ерітіндінің тұз концентрациясы, қышқылдығы (заряд) және гидрофобтылығы арқылы ДНҚ-ны колоннамен байланыстыру.Сондықтан электрофорез буферінің рН тым жоғары болса, зольге 10ул (рН 5,0, 3моль/л NaAC) қосуға болады;мембранадағы ДНҚ молекулаларын жақсырақ ұстау үшін желім ерігеннен кейін сұйықтыққа қыздыру үшін 30% изопропанол қосуға болады.

7. Элюентті қоспас бұрын, этанолды толығымен буландыру үшін колонканы бөлме температурасында бірнеше минутқа (шамамен 10 минут) қалдырыңыз.

8. Соңында қалпына келтіру көлемін азайту үшін азырақ элюент қосыңыз.Әдетте элюция үшін 30-50мкл элюент қолданылады (тым аз емес, әйтпесе ол элюцияға қолайлы емес мембрананы сулай алмайды);мембранамен байланысқан ДНҚ-ны толығымен элюциялау үшін элюция тамшылары мембрананың ортасында орналасады.

9. Элюентті қосқаннан кейін оны 55 градус су моншасында 5 минут бойы элюциялауға немесе 50 градус су моншасына 10 минуттан артық орналастыруға немесе түнде 4 градус температурада парафильммен тығыздауға болады, содан кейін келесі күні қалпына келтіру үшін центрифугалауға болады, әсері жақсы.

10. Центрифугаланған элюатты қайтадан адсорбциялық бағанға қосыңыз және қайтадан центрифугалаңыз.

ПТР өнімді қалпына келтірудің егжей-тегжейлі әдістері мен процедуралары

1. Кәдімгі резеңке қайта өңдеу

Егер сіз желімді қалпына келтіргіңіз келсе, ыңғайлы және қалпына келтіру жылдамдығы сәл жоғары болатын жинақты қолданған дұрыс.Егер шынымен қолмен қалпына келтіру қажет болса, желімді кескеннен кейін TE көлемін 3 есе арттыруға болады.Су моншасында ерігеннен кейін фенол, фенол/хлороформ таза экстракцияланады, ал этанол тұнбаға түседі.Міне бітті.

2. Балқу температурасы төмен гельдерден ДНҚ қалпына келтіру

ДНҚ фрагменттерін тазарту Гель көлеміне тең TE (10 ммоль/л Tris-HCl pH8,0, 0,1 ммоль/л ЭДТА) қосып, гельді толығымен еріту үшін 65°C су моншасына 5 минутқа қойыңыз.

Бөлме температурасына дейін жеткізгеннен кейін тең мөлшерде фенол (ТЭ-мен қаныққан, ТЭ жоғарғы қабатта тығыздалған және фенолдың төменгі қабаты жойылған) қосылып, қоспаны ақырын араластырады (араластыру қажет емес) және 12000 айн/мин 3 минут бойы центрифугалайды.1-2 рет қайталаңыз.

Жоғарғы затты алыңыз, этанолды тұндыру үшін 0,1 көлем 3моль/л натрий ацетаты (рН 5,2) және абсолютті этанолдың 2,5 есе көлемін қосыңыз.Тазартылған ДНҚ-ны ТЭ тиісті мөлшерімен ерітіңіз, мазмұнын өлшеңіз және пайдалануға дайындаңыз (оны мақсатты ген құрылымын талдау, зонд дайындау және т.б. үшін пайдалануға болады).

3. Жақсы күшейту ерекшелігімен ПТР қалпына келтіру

ПТР күшейту ерекшелігі жақсы болса, бұл жай ғана ПТР өнімін тазарту және қалпына келтіру.ПТР өніміне 50г/мл протеиназа K қосуға болады, 1 сағат бойы 37 градус, фенол/хлороформмен бір рет экстракция, хлороформмен бір рет экстракция және үстіңгі заттың 0,1 көлемін қосуға болады.Натрий ацетаты абсолютті этанолдың 2,5 көлемімен тұндыру арқылы алынды.

Қосымша тауарлар:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/