COVID-19 – ауыр жіті респираторлық синдром 2 типті коронавирус тудыратын жұқпалы ауру. Адам жұқтырған кезде ең жиі кездесетін белгілерге қызба, жөтел және ентігу жатады.

Сынақ үшін пайдаланылатын үлгілерді мұрын-жұтқыншақ жағындылары немесе орофарингеальды жағындылар арқылы жинауға болады.

ПТР дегеніміз не?

Коронавирусты анықтаудың стандартты әдісі – полимеразды тізбекті реакция, ПТР.Бұл молекулалық биологияда кеңінен қолданылатын әдіс.Ол миллиондаған нақты ДНҚ фрагменттерін жылдам көшіре алады.

Жаңа коронавирустың құрамында өте ұзын бір тізбекті РНҚ геномы бар.Бұл вирустарды ПТР арқылы анықтау үшін РНҚ молекулалары кері транскриптаза арқылы олардың комплементарлы ДНҚ тізбегіне айналуы керек, содан кейін жаңадан синтезделген ДНҚ стандартты ПТР процедуралары арқылы күшейтілуі мүмкін, ол әдетте RT-PCR деп аталады.

RT-ПТР процесі

РНҚ экстракциясы

Бұл әдісті орындау үшін вирустық РНҚ негізінен экстракциялануы керек.Ыңғайлы, жылдам және тиімді бөлу үшін әртүрлі РНҚ тазарту жинақтарын пайдалануға болады.

Коммерциялық жинақты пайдаланып вирустық РНҚ алу үшін алдымен үлгіні микроцентрифуга түтігіне қосыңыз, содан кейін оны лизис буферімен араластырыңыз.Бұл буфер жоғары денатуратталған және әдетте фенол мен гуанидин-изотиоцианаттан тұрады.Сонымен қатар, RNase ингибиторлары, әдетте, бұзылмаған вирустық РНҚ оқшаулануын қамтамасыз ету үшін лизис буферінде болады.

Лизис буферін қосқаннан кейін араластыру түтігін импульс арқылы құйып, бөлме температурасында инкубациялаңыз.Содан кейін вирус лизис буферімен қамтамасыз етілген жоғары денатурациялау жағдайында лизиске ұшырайды.

Үлгі лизиден кейін тазарту процедурасы үшін центрифуга түтігі пайдаланылады.Үлгі центрифуга түтігіне жүктеледі, содан кейін центрифугаланады.

Бұл процедура стационарлы фаза силикагель матрицасынан тұратын қатты фазалық экстракция әдісі болып табылады.

Оңтайлы тұз және рН жағдайында РНҚ молекулалары кремнеземдік мембранамен байланысады.

Сонымен бірге ақуыз және басқа ластаушы заттар жойылады.

Центрифугадан кейін центрифуга түтігін таза жинау түтігіне салыңыз, фильтратты тастаңыз, содан кейін жуу буферін қосыңыз.

Жуу буферін мембрана арқылы өткізу үшін түтікті қайтадан центрифугаға салыңыз.Бұл мембранадан қалған барлық қоспаларды алып тастап, тек силикагелмен байланысқан РНҚ қалдырады.

Үлгіні жуғаннан кейін түтікті таза микроцентрифуга түтігіне салып, элюционды буферді қосыңыз.

Содан кейін элюционды буферді мембрана арқылы өткізу үшін центрифугаланады.Элюционды буфер спин бағанынан вирустық РНҚ-ны жояды және ақуыздардан, ингибиторлардан және басқа ластаушылардан тазартылған РНҚ алады.

2-ҚАДАМ

Аралас концентрат

Вирустық РНҚ-ны бөліп алғаннан кейін келесі қадам ПТР күшейту үшін реакциялық қоспаны дайындау болып табылады.Бұл қадамда концентрат қолданылады.Бұл концентрлі ерітінді премикстен, кері транскриптазадан, нуклеотидтерден, тура праймерден, кері праймерден, TaqMan зондынан және ДНҚ полимеразасынан тұратын алдын ала араластырылған концентрлі ерітінді.

Соңында, осы реакция қоспасын аяқтау үшін РНҚ үлгісі қосылады.Түтіктер импульстік құйындымен араластырылады, содан кейін реакция қоспасы ПТР пластинасына жүктеледі.ПТР тақтасында әдетте 96 шұңқыр бар және бір уақытта бірнеше үлгіні талдай алады.

3-ҚАДАМ

ПТР күшейту

Содан кейін пластинаны ПТР машинасына салыңыз, ол негізінен термиялық циклгер болып табылады.

Нақты уақыттағы RT-ПТР RdrRP геніндегі, E геніндегі және N геніндегі мақсатты тізбекті күшейту арқылы 2019 жылғы жаңа коронавирусты анықтау үшін қолданылады.Мақсатты генді таңдау праймер мен зонд тізбегіне байланысты.

RT-ПТР бірінші қадамы кері транскрипция болып табылады.Комплементарлы ДНҚ-ның бірінші тізбегі синтезделеді, ол вирустық РНҚ геномының комплементарлы бөлігімен байланысатын ПТР кері праймерімен басталады.Содан кейін кері транскриптаза вирустық РНҚ-ға комплементарлы ДНҚ синтездеу үшін праймердің 3′ ұшына ДНҚ нуклеотидтерін қосады.Бұл қадамның температурасы мен ұзақтығы праймерлерге, мақсатты РНҚ-ға және қолданылатын кері транскриптазаға байланысты.

Содан кейін бастапқы денатурация қадамы қолданылады, бұл РНҚ-ДНҚ гибридінің денатурациясына әкеледі.Бұл қадам ДНҚ-полимеразаны белсендіру үшін қажет.Бұл ретте кері транскриптаза инактивацияланады.

ПТР термиялық циклдар сериясынан тұрады.Әрбір цикл денатурация, жасыту және ұзарту қадамдарынан тұрады.

Денатурация қадамы реакция камерасын 95 градус Цельсийге дейін қыздыруды және оны қос тізбекті ДНҚ үлгісін денатурациялау үшін пайдалануды қамтиды.

Келесі қадамда реакция температурасы Цельсий бойынша 58 градусқа дейін төмендейді, бұл алдыңғы праймердің бір тізбекті ДНҚ үлгісінің қосымша бөлігіне күйдірілуіне мүмкіндік береді.Жасыту температурасы праймердің ұзындығы мен құрамына тікелей байланысты.

Кеңейту сатысында ДНҚ-полимераза ДНҚ шаблон тізбегіне комплементарлы жаңа ДНҚ тізбегін синтездейді.Реакция қоспасынан 5′-3′бағытта шаблонға қосымша бос ядроларды қосу арқылы.Бұл кезеңнің температурасы қолданылатын ДНҚ полимеразасына байланысты.

Бірінші циклден кейін қос тізбекті ДНҚ нысанасы алынады.

Содан кейін екінші циклды енгізіңіз.Екі тізбекті ДНҚ денатурацияланып, екі бір тізбекті ДНҚ молекуласын түзеді.

Келесі қадамда реакция температурасы төмендетіледі, праймерлер әрбір бір тізбекті ДНҚ шаблонына күйдіріледі, ал Taq-man зонды мақсатты ДНҚ-ның комплементарлы бөлігіне күйдіріледі.

TaqMan зонды олигонуклеотидті зондтың 5′ ұшымен ковалентті байланысқан флюорофордан тұрады.Циклдің жарық көзімен қоздырылған кезде флюорофор флуоресценция шығарады.Сонымен қатар, зонд 3′ұшындағы сөндіргіштен тұрады.Репортер генінің сөндіргішке жақындығы флуоресценцияны анықтауға кедергі жасайды.

Кеңейту сатысында ДНҚ-полимераза жаңа тізбекті синтездейді.Полимераза TaqMan зондына жеткенде, оның эндогендік 5′нуклеаза белсенділігі бояғышты сөндіргіштен бөліп, зондты ажыратады.

ПТР әрбір циклімен көбірек бояғыш молекулалар шығарылады, нәтижесінде синтезделген ампликондар санына пропорционал флуоресценция қарқындылығы артады.

Бұл әдіс үлгідегі берілген реттілік санын бағалауға мүмкіндік береді.Әрбір циклде қос тізбекті ДНҚ фрагменттерінің саны екі есе артады.Сондықтан ПТР өте кішкентай үлгілерді талдау үшін пайдаланылуы мүмкін.

Флуоресцентті сигналды, вольфрамды галогендік шамды, қоздыру сүзгісін, шағылыстырғышты, линзаларды, эмиссия сүзгісін және зарядпен байланыстырылған құрылғыны өлшеу үшін CCD камерасы қолданылады.

4-ҚАДАМ Анықтау

Флуоресцентті сигналды, вольфрамды галогендік шамды, қоздыру сүзгісін, шағылыстырғышты, линзаларды, эмиссия сүзгісін және зарядпен байланыстырылған құрылғыны өлшеу үшін CCD камерасы қолданылады.

Шамнан сүзілген жарық шағылыстырғыш арқылы шағылысады, конденсатор линзасы арқылы өтеді және әрбір тесіктің ортасына бағытталған.Содан кейін тесіктен шығарылатын флуоресценция айнадан көрінеді, эмиссия сүзгісінен өтеді және CCD камерасы арқылы анықталады.Әрбір ПТР циклінде өзін-өзі қоздыратын флюорофор жарығын CCD арқылы анықтауға болады.

Ол түсірілген жарықты сандық деректерге түрлендіреді.Бұл әдіс нақты уақыттағы ПТР деп аталады және ол ПТР реакциясының барысын нақты уақытта бақылауға мүмкіндік береді.