Менің ойымша, анықтау технологиясының тарихындағы бірнеше революциялық өнертабыстар антиген-антидененің арнайы байланысы, ПТР технологиясы және секвенирлеу технологиясына негізделген иммунотаңбалау технологиясы болып табылады.Бүгін біз ПТР технологиясы туралы айтатын боламыз.ПТР технологиясының эволюциясына сәйкес адамдар ПТР технологиясын әдетте үш ұрпаққа бөледі: қарапайым ПТР технологиясы, нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР технологиясы және цифрлық ПТР технологиясы.
Cжалпы ПТР әдісі
ҚАРЫ МУЛЛИС (1944.12.28-2019.8.7)
Кари Муллис 1983 жылы полимеразды тізбекті реакцияны (полимеразды тізбекті реакция , ПТР) ойлап тапты. Айтуларынша, ол өзінің құрбысын жүргізіп келе жатқанда кенет шабыттанып, ПТР принципін (көлік жүргізудің пайдасы туралы) ойлады.Кари Муллис 1993 жылы химия бойынша Нобель сыйлығының лауреаты атанды. The New York Times газеті былай деп түсіндірді: «Биологияны ПТР-ға дейінгі және ПТР-дан кейінгі кезеңдерге екіге бөлетін өте ерекше және маңызды.
ПТР принципі: ДНҚ-полимераза катализінде үлгі ретінде аналық тізбек ДНҚ пайдаланылады, ал спецификалық праймер ұзартудың бастапқы нүктесі ретінде пайдаланылады, ал ДНҚ аналық тізбек шаблонына комплементарлы аналық тізбек ДНҚ денатурация, жасыту, ұзарту және басқа қадамдар арқылы in vitro көшіріледі.Бұл in vitro ДНҚ синтезін күшейту технологиясы, ол in vitro кез келген мақсатты ДНҚ-ны жылдам және арнайы күшейте алады.
Қарапайым ПТР артықшылығы
1.Классикалық әдіс, толық халықаралық және отандық стандарттар
2.Құрал реагенттерінің төмен құны
3.ПТР өнімдерін басқа молекулалық биология эксперименттері үшін қалпына келтіруге болады
Ұсынылатын Foregene ПТР аппараты: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Қатысты өнімдер: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Қарапайым ПТР-ның кемшіліктері
1.оңай ластануы
2.ауыр операция
3.тек сапалық талдау
4.Орташа сезімталдық
5.Арнайы емес күшейту бар және спецификалық емес жолақ мақсатты жолақпен бірдей өлшемде болғанда, оны ажырату мүмкін емес.
Cапиллярлық электрофорез негізіндегі ПТР
Кәдімгі ПТР кемшіліктеріне жауап ретінде кейбір өндірушілер капиллярлық электрофорез принципіне негізделген құралдарды енгізді.Капиллярда ПТР күшейтуден кейінгі электрофорез қадамы аяқталады.Сезімталдық жоғарырақ және бірнеше негіздердің айырмашылығын ажыратуға және күшейтуді MAERKER арқылы есептеуге болады.өнім мазмұны.Кемшілігі - ПТР өнімін әлі де ашу және құралға салу қажет және ластану қаупі әлі де бар.
CапиллярлыEэлектрофорез
2. Нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР (Quantitative Real-time PCR, qPCR) технологиясыФлуоресцентті сандық ПТР, оны нақты уақыттағы ПТР деп те атайды, 1995 жылы PE (Перкин Элмер) әзірлеген нуклеин қышқылының жаңа сандық технологиясы болып табылады. Флуоресцентті сандық ПТР даму тарихы ABI, Roche және Bio-Rad сияқты алыптардың жан тебірентетін күресінің тарихы болып табылады.Егер сізді қызықтырса, сіз оны тексере аласыз.Бұл әдіс қазіргі уақытта ең жетілген және кеңінен қолданылатын жартылай сандық ПТР әдісі болып табылады.
Ұсынылатын qPCR құрылғысы:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Флуоресцентті бояу әдісі (SYBR Green I):SYBR Green I – екі тізбекті ДНҚ-мен спецификалық емес байланысатын сандық ПТР үшін ең жиі қолданылатын ДНҚ-байланыстырушы бояғыш.Еркін күйде SYBR Green әлсіз флуоресценция шығарады, бірақ қос тізбекті ДНҚ-мен байланысқаннан кейін оның флуоресценциясы 1000 есе артады.Демек, реакция шығаратын жалпы флуоресцентті сигнал қос тізбекті ДНҚ мөлшеріне пропорционалды және күшейтілген өнімнің ұлғаюымен артады.Бояғыш қос тізбекті ДНҚ-мен спецификалық емес байланысқандықтан, жалған оң нәтижелер туындауы мүмкін.
Қатысты өнімдер: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Флуоресцентті зонд әдісі (Такман технологиясы): КезіндеПТР күшейту, арнайы флуоресцентті зонд праймер жұбымен бір уақытта қосылады.Зонд сызықтық олигонуклеотид болып табылады, оның екі ұшында сәйкесінше флуоресцентті репортер тобы және флуоресцентті сөндіруші тобы бар.Зонд бүтін болған кезде репортер тобы шығаратын флуоресцентті сигналды сөндіруші топ жұтады, ал анықтау Флуоресцентті сигнал жоқ;ПТР күшейту кезінде (кеңейту сатысында) Taq ферментінің 5'-3' Дисер белсенділігі зондты қорытады және деградациялайды, осылайша репортер флуоресцентті топ пен сөндіруші флуоресцентті топ бөлінеді, осылайша флуоресцентті бақылау жүйесі Флуоресцентті сигналды алуға болады, яғни ДНҚ тізбегі немесе тұмау синхронизациясы толық күшейген сайын, флуоресцентті сигналдардың жинақталуы және ПТР өнімдерінің түзілуі.Такман зонд әдісі - клиникалық анықтауда ең жиі қолданылатын анықтау әдісі.
Қатысты өнімдер: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR артықшылықтары
1.Әдіс пісіп-жетілген және тірек жабдықтар мен реагенттер толық
2.Реагенттердің орташа құны
3.қолдануға оңай
4.Анықтаудың жоғары сезімталдығы мен ерекшелігі
qPCR кемшіліктері
Мақсатты геннің мутациясы өткізіп алынған анықтауға әкеледі.
Төмен концентрация үлгісін анықтау нәтижесін анықтау мүмкін емес.
Сандық анықтау үшін стандартты қисықты пайдалану кезінде үлкен қателік бар.
3. Сандық ПТР (цифрлық ПТР, dPCR) технологиясы
Цифрлық ПТР – нуклеин қышқылы молекулаларының абсолютті мөлшерін анықтауға арналған әдіс.qPCR-мен салыстырғанда цифрлық ПТР ДНҚ/РНҚ молекулаларының санын тікелей оқи алады, бұл бастапқы үлгідегі нуклеин қышқылы молекулаларының абсолютті сандық көрсеткіші.1999 жылы Берт Фогельштейн мен Кеннет В.Кин-злер ресми түрде dPCR тұжырымдамасын ұсынды.
2006 жылы Fluidigm бірінші болып коммерциялық чипке негізделген dPCR құралын шығарды.2009 жылы Life Technologies OpenArray және QuantStudio 12K Flex dPCR жүйелерін іске қосты.2013 жылы Life Technologies үлгілерді 20 000 жеке ұяшыққа біркелкі тарату үшін жоғары тығыздықтағы наноөлшемді микрофлюидтік чип технологиясын қолданатын QuantStudio 3DdPCR жүйесін іске қосты.реакцияда жақсы.
2011 жылы Bio-Rad тамшы негізіндегі QX100 dPCR құралын іске қосты, ол үлгіні 20 000 тамшы-мұнайдағы суға біркелкі тарату үшін су-май технологиясын пайдаланады және тамшыларды талдау үшін тамшы анализаторын пайдаланады.2012 жылы RainDance әрбір стандартты реакция жүйесін құрамында 1 миллионнан 10 миллионға дейін пиколитр деңгейіндегі микро тамшылардан тұратын реакция эмульсиясына бөлу үшін жоғары қысымды газбен басқарылатын RainDrop dPCR құралын іске қосты.
Осы уақытқа дейін цифрлық ПТР екі негізгі фракцияны құрады, чип түрі және тамшы түрі.Цифрлық ПТР қандай түріне қарамастан, оның негізгі принциптері сұйылтуды шектеу, ПТР соңғы нүктесі және Пуассон үлестірімі болып табылады.Құрамында нуклеин қышқылының шаблондары бар стандартты ПТР реакция жүйесі он мыңдаған ПТР реакцияларына біркелкі бөлінеді, олар чиптерге немесе микротамшыларға таратылады, осылайша әрбір реакция мүмкіндігінше шаблондық молекуланы қамтиды және бір молекулалы үлгілік ПТР реакциясы орындалады.Флуоресценцияны оқу арқылы сигналдың бар немесе жоқтығы есептеледі, ал абсолютті сандық анықтау статистикалық Пуассон үлестірімін калибрлеуден кейін орындалады.
Төменде мен пайдаланған бірнеше сандық ПТР платформаларының сипаттамалары берілген:
1. Bio-Rad QX200 тамшы сандық ПТР Bio-RadQX200 - өте классикалық цифрлық ПТР платформасы, негізгі анықтау процесі: 20 000 үлгі тамшылар генераторымен жасалады Мұнайдағы судың микро тамшылары кәдімгі ПТР машинасында күшейтіледі және соңында әрбір микро тамшының флуоресценция сигналы микро тамшыларды оқу құралы арқылы оқылады.Операция күрделірек, ал ластану қаупі орташа.
Xinyi TD1 микро-тамшылы цифрлық ПТРXinyi TD1 - отандық цифрлық ПТР платформасы, негізгі анықтау процесі: тамшы генераторы арқылы 30 000-50 000 майдағы су тамшыларын генерациялау, жалпы ПТР құралында күшейту және соңында өту Тамшыларды оқу құралы әрбір тамшының флуоресценттік сигналын оқиды.Бұл платформада тамшылардың пайда болуы да, оқу да ластану қаупі төмен арнайы чипте орындалады.
STILLA Naica микро-тамшылы чип цифрлық ПТРSTILLA Naica - салыстырмалы түрде жаңа сандық ПТР платформасы.Негізгі анықтау процесі: чипке реакция ерітіндісін қосу, микро тамшыларды генерациялау және күшейту жүйесіне чипті қою және 30 000 микро тамшыларды жасау.Чипте таралады және чипте ПТР күшейту аяқталды.Содан кейін күшейтілген чип микротамшыны оқуды талдау жүйесіне беріледі, ал флуоресцентті сигнал суретке түсіру арқылы оқылады.Бүкіл процесс жабық чипте өтетіндіктен, ластану қаупі төмен.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D чипі сандық ПТР
ThermoFisher QuantStudio 3D тағы бір классикалық чипке негізделген цифрлық ПТР платформасы.Оның негізгі анықтау процесі: таратқышқа реакция ерітіндісін қосыңыз және реакция ерітіндісін таратқыш арқылы 20 000 шағын түтіктері бар чипке біркелкі таратыңыз., күшейту үшін чипті ПТР машинасына салыңыз, соңында чипті оқырманға салып, флуоресцентті сигналды оқу үшін суретке түсіріңіз.Операция салыстырмалы түрде күрделі және бүкіл процесс жабық чипте жүзеге асырылады және ластану қаупі төмен.
5. JN MEDSYS Clarity чипі сандық ПТР
JN MEDSYS Clarity - салыстырмалы түрде жаңа чип түріндегі цифрлық ПТР платформасы.Оның негізгі анықтау процесі: аппликаторға реакция ерітіндісін қосыңыз және реакция ерітіндісін аппликатор арқылы ПТР түтігіне бекітілген 10 000 ПТР түтіктеріне біркелкі таратыңыз.Микрокеуекті чипте реакция ерітіндісі капиллярлық әсер арқылы чипке түседі, ал чипі бар ПТР түтігі күшейту үшін ПТР аппаратына орналастырылады, ең соңында фотосуретке түсіру арқылы флуоресцентті сигналды оқу үшін чип оқырманға салынады.Операция күрделірек.Ластану қаупі төмен.
Әрбір сандық ПТР платформасының параметрлері төмендегідей жинақталған:
Цифрлық ПТР платформасының бағалау көрсеткіштері: бөлу бірліктерінің саны, флуоресцентті арналардың саны, жұмыстың күрделілігі және ластану қаупі.Бірақ ең бастысы - анықтау дәлдігі.Цифрлық ПТР платформаларын бағалаудың бір жолы – бірін-бірі тексеру үшін бірнеше сандық ПТР платформаларын пайдалану, ал басқа жолы – дәл мәндері бар стандартты заттарды пайдалану.
dPCR артықшылықтары
1.Абсолютті мөлшерлеуге қол жеткізу
2.Жоғары сезімталдық пен ерекшелік
3.Төмен көшірме үлгілерін анықтай алады
dPCR кемшіліктері1. Қымбат жабдық пен реагенттер 2. Күрделі жұмыс және ұзақ анықтау уақыты 3. Анықтау диапазоны тар
Қазіргі уақытта ПТР технологиясының үш буынының өзіндік артықшылықтары мен кемшіліктері бар және әрқайсысының өз қолдану өрістері бар және бір ұрпақ екіншісін алмастыратын байланыс емес.Технологияның үздіксіз дамуы ПТР технологиясына жаңа өміршеңдік енгізіп, оны бірінен соң бірі қолдану бағытын ашуға мүмкіндік беріп, нуклеин қышқылын анықтауды ыңғайлы және дәлірек етеді.
Дереккөз: Доктор Юань сізді тестілеуге алып барады
Ұсынылатын өнімдер:
Жіберу уақыты: 18 қараша 2022 ж
