Нақты уақыттағы ПТР, сонымен қатар сандық ПТР немесе qPCR ретінде белгілі, ПТР күшейту өнімдерін нақты уақыттағы бақылау және талдау әдісі.
Сандық ПТР қарапайым жұмыс, жылдам және ыңғайлы, жоғары сезімталдық, жақсы қайталану және төмен ластану жылдамдығының артықшылықтарына ие болғандықтан, ол медициналық тестілеуде, дәрілік заттардың тиімділігін бағалауда, ген экспрессиясын зерттеуде, трансгендік зерттеулерде, гендерді анықтауда, патогенді анықтауда, жануарлар мен өсімдіктерді анықтауда кеңінен қолданылады., тағамдық сынақтар және басқа салалар.
Сондықтан, сіз өмір туралы ғылымдар бойынша іргелі зерттеулермен айналысасыз ба, немесе фармацевтикалық компаниялардың, мал шаруашылығы компанияларының, азық-түлік компанияларының қызметкерлері немесе тіпті кіру-шығу инспекциясы мен карантиндік бюролардың, қоршаған ортаны бақылау бөлімдерінің, ауруханалардың және басқа бөлімшелердің қызметкерлері болсаңыз да, сіз азды-көпті әсер етесіз немесе сандық ПТР-ны меңгеру білімін білуіңіз керек.

Нақты уақыттағы ПТР принципі

Нақты уақыттағы ПТР – бұл флуоресцентті заттар ПТР реакциясы жүйесіне қосылатын әдіс және ПТР реакциясы процесінде флуоресценция сигналының қарқындылығы нақты уақыт режимінде сандық ПТР құралы арқылы бақыланады, соңында эксперименттік деректер талданады және өңделеді.

【Күшейту қисығы】ПТР динамикалық процесін сипаттайтын қисық болып табылады.ПТР күшейту қисығы шын мәнінде стандартты экспоненциалды қисық емес, сигма тәрізді қисық болып табылады.

[Күшейту қисығының платформалық фазасы]ПТР циклдарының санының артуы, ДНҚ-полимеразаның инактивациясы, dNTP және праймерлердің азаюы және реакцияның жанама өнімі пирофосфатпен синтез реакциясының тежелуі және т.б., ПТР әрқашан экспоненциалды түрде кеңейе бермейді., және ақырында үстіртке кіреді.

[Күшейту қисығының экспоненциалды өсу аймағы]Плато фазасы айтарлықтай өзгерсе де, күшейту қисығының экспоненциалды өсу аймағының белгілі бір аймағында қайталану мүмкіндігі өте жақсы, бұл ПТР сандық талдауы үшін өте маңызды.

[Шекті мән және Ct мәні]Біз флуоресценцияны анықтаудың шекті мәнін күшейту қисығының экспоненциалды өсу аймағындағы сәйкес позицияға орнаттық, атап айтқанда шекті мән (Табалдырық).Шекті мән мен күшейту қисығының қиылысуы Ct мәні болып табылады, яғни Ct мәні шекті мәнге жеткен кездегі циклдар санын (Табалдырық циклі) білдіреді.

Төмендегі график табалдырық сызығы мен күшейту қисығы, шекті мән және Ct мәні арасындағы байланысты анық көрсетеді.

【Санды қалай анықтауға болады?】

Ct шамасының бастапқы шаблондар санының логарифмімен кері сызықтық байланысы бар екендігі математикалық теориямен дәлелденді.Нақты уақыттағы ПТР нақты уақытта ПТР күшейту өнімдерін бақылайды және экспоненциалды күшейту фазасында олардың санын анықтайды.

ПТР әрбір циклі үшін ДНҚ экспоненциалды түрде 2 есе өсті және көп ұзамай платоға жетті.

Бастапқы ДНҚ мөлшері А деп есептесек₀ , n циклден кейін ДНҚ өнімінің теориялық мөлшерін мына түрде көрсетуге болады:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Содан кейін, бастапқы ДНҚ мөлшері A 0 неғұрлым көп болса, күшейтілген өнім мөлшері анықтау An мәніне соғұрлым тез жетеді және An жеткен кездегі циклдар саны Ct мәні болады.Яғни, ДНҚ-ның бастапқы мөлшері А 0 неғұрлым көп болса, соғұрлым күшейту қисығы шыңына жетеді және сәйкесінше циклдердің қажетті саны n аз болады.

Біз белгілі концентрация стандартын градиентті сұйылтуды жүргіземіз және оны нақты уақыттағы ПТР үлгісі ретінде қолданамыз және ДНҚ мөлшерінің басталу реті бойынша бірдей аралықта күшейту қисықтарының қатары көптен азға дейін алынады.Ct мәні мен бастапқы шаблондар санының логарифмі арасындағы сызықтық қатынасқа сәйкес,[стандартты қисық] жасауға болады.

Белгісіз концентрациясы бар үлгінің Ct мәнін стандартты қисыққа ауыстыру арқылы нақты уақыттағы ПТР сандық принципі болып табылатын белгісіз концентрациясы бар үлгінің бастапқы шаблондық мөлшерін алуға болады.

Нақты уақыттағы ПТР анықтау әдісі

Нақты уақыттағы ПТР реакция жүйесіндегі флуоресценция қарқындылығын анықтау арқылы ПТР күшейту өнімдерін анықтайды.

Флуоресцентті бояуды енгізу әдісінің принципі】

Флуоресцентті бояғыштарTB Green ® сияқты , ПТР жүйелеріндегі қос тізбекті ДНҚ-мен спецификалық емес байланыса алады және байланыстыру кезінде флуоресцентті болады.

Реакция жүйесіндегі флуоресценция қарқындылығы ПТР циклдерінің ұлғаюымен экспоненциалды түрде өсті.Флуоресценция қарқындылығын анықтау арқылы реакция жүйесіндегі ДНҚ күшейту мөлшерін нақты уақытта бақылауға болады, содан кейін үлгідегі бастапқы шаблонның мөлшерін кері бағалауға болады.

【Флуоресцентті зонд әдісінің принципі】

флуоресцентті зонд5′ ұшында флуоресцентті тобы және 3′ ұшында сөндіргіш тобы бар нуклеин қышқылдарының тізбегі шаблонмен арнайы байланыса алады.Зонд бүтін болған кезде, флюорофор шығаратын флуоресценция сөндіруші топпен сөндіріледі және флуоресценциялана алмайды.Зонд ыдырағанда, флуоресцентті зат диссоциацияланады және флуоресценция шығарады.

Флуоресцентті зонд ПТР реакциясының ерітіндісіне қосылады.Жасыту процесі кезінде флуоресцентті зонд шаблонның нақты орнына байланады.Кеңейту процесі кезінде ПТР ферментінің 5′→3′ экзонуклеаза белсенділігі шаблонмен будандастырылған флуоресцентті зондты ыдыратуы мүмкін, ал флуоресцентті зат флуоресценция шығару үшін диссоциацияланады.Реакция жүйесінде зондтың флуоресценция қарқындылығын анықтау арқылы ПТР өнімінің күшейту мөлшерін бақылау мақсатына қол жеткізуге болады.

【Флуоресценцияны анықтау әдісін таңдау】

Егер ол жоғары гомологиясы бар тізбектерді ажырату және SNP теру талдауы сияқты мультиплексті ПТР анықтауды орындау үшін пайдаланылса, флуоресцентті зонд әдісі алмастырылмайды.
Нақты уақыттағы басқа ПТР тәжірибелері үшін қарапайым, жеңіл және арзан флуоресцентті химера әдісін қолдануға болады.

зонд Күшті ерекшелік, мультиплекстік ПТР қабілетті

Кемшілік

Күшейтуге жоғары ерекшелік талаптары;

мультиплексті ПТР жүргізу мүмкін емес Арнайы зондтарды жобалау қажет, жоғары құны;

кейде зондты жобалау қиынға соғады

Қосымша тауарлар: