1. РНҚ ерітіндісінің сіңіру қабілетін анықтаңыз
280, 320, 230 және 260 нм абсорбция сәйкесінше нуклеин қышқылының, фонның (ерітіндінің бұлдырлығы), тұз концентрациясының және ақуыз сияқты органикалық заттардың мәндерін білдіреді.Әдетте тек OD260/OD280 (Ratio, R) қараңыз.1,8~2,0 болғанда, РНҚ-дағы ақуыздың немесе басқа органикалық заттардың ластануына жол беруге болады деп ойлаймыз, бірақ сіңіруді анықтау үшін Tris буфері ретінде пайдаланылғанда, R мәні 2-ден жоғары болуы мүмкін екенін ескеру керек (әдетте ол <2,2 болуы керек).R<1,8 болғанда ерітіндідегі белоктың немесе басқа органикалық заттардың ластануы айқынырақ болады және РНҚ тағдырын қажеттілікке қарай анықтауға болады.R>2,2 болғанда, бұл РНҚ бір нуклеин қышқылына гидролизденгенін білдіреді.
2.РНҚ-ның электрофоретикалық үлгісі
Әдетте денатурациялаушы гель РНҚ электрофорезі үшін қолданылады, бірақ егер ол тек РНҚ сапасын анықтау үшін болса, денатурациялаушы гель қажет емес, қарапайым агарозды гельді қолдануға болады.Электрофорездің мақсаты 28S және 18S жолақтарының тұтастығын және олардың арақатынасын немесе мРНҚ жағындысының тұтастығын анықтау.Жалпы, егер 28S және 18S жолақтары жарқын, анық және өткір болса (жолақтардың жиектері анық) және 28S жарықтығы 18S жолағынан екі есе артық болса, біз РНҚ сапасы жақсы деп есептейміз.
Жоғарыда біз жиі қолданатын екі әдіс бар, бірақ бұл екі әдістің ешқайсысы бізге РНҚ ерітіндісінде қалдық RNase бар-жоғын анық айта алмайды.Егер ерітіндіде RNase өте аз болса, оны жоғарыдағы әдіспен анықтау біз үшін қиын, бірақ кейінгі ферментативті реакциялардың көпшілігі 37 градустан жоғары және ұзақ уақыт бойы жүргізіледі.Осылайша, егер РНҚ ерітіндісінде РНҚ-ның өте аз мөлшері болса, онда кейінгі тәжірибелерде олардың рөлін атқаруға өте қолайлы орта мен уақыт болады және әрине бұл кезде тәжірибе суық болады.Төменде РНҚ ерітіндісінде қалдық RNase бар-жоғын растай алатын әдісті енгіземіз.
3. Жылуды сақтау сынағы
Үлгі концентрациясына сәйкес РНҚ ерітіндісінен екі 1000 нг РНҚ алыңыз және оны 0,5 мл центрифугалық түтікке қосыңыз және оны рН 7,0 Tris буферімен жалпы көлемі 10 мульге дейін толықтырыңыз, содан кейін түтіктің қақпағын жабыңыз.Олардың біреуін тұрақты температурада 70°С су моншасына салып, 1 сағат бойы жылы ұстаңыз.Қалған бөлігі -20°C тоңазытқышта 1 сағат сақталады.Уақыт аяқталғаннан кейін электрофорезге арналған екі үлгіні алыңыз.Электрофорез аяқталғаннан кейін екеуінің электрофорездік жолақтарын салыстырыңыз.Екеуінің жолақтары сәйкес келсе немесе айтарлықтай айырмашылығы болмаса (әрине, олардың жолақтары да 2-әдістегі шарттарға сәйкес келеді), бұл РНҚ ерітіндісінде қалдық РНҚ ластануының жоқтығын және РНҚ сапасының өте жақсы екенін білдіреді.Керісінше, 70°C инкубацияланған үлгіде айқын деградация байқалса, бұл РНҚ ерітіндісінде RNase ластануы бар екенін көрсетеді.
2 РНҚ экстракциясының эксперименттік әдістері мен әдістері
РНҚ алу кезінде жиі кездесетін мәселелер: (1) РНҚ шығымы төмен;(2) РНҚ-ның тұзды қатты ластауы;(3) РНҚ елеулі органикалық еріткішпен ластануы бар;(4) үлгінің деградациясы және басқа мәселелер
1. Жиі қолданылатын жалпы РНҚ экстракциялық реагенттер
Гуанидин-изотиоцианат әдісі және Тризол әдісі жануарлар ұлпаларынан және жануарлар жасушаларынан жалпы РНҚ экстракциялаудың ең жиі қолданылатын әдістері болып табылады.Ол әсіресе қоян терісінен және жануарлардың дәнекер тінінен жалпы РНҚ экстракциясы сияқты экстракциялау өте қиын шағын үлгілер мен тіндер үшін қолайлы;Сонымен қатар, Тризолды жалпы мақсаттағы лизис реагенті ретінде өсімдік тіндерін, бактерияларды, саңырауқұлақтарды және басқа тіндерді алу үшін де қолдануға болады.Құрамында полисахаридтер мен полифенолдар бар өсімдік тіндері үшін, мысалы, камеллия олейферасы, шай жапырақтары, рапс және т.б., жалпы РНҚ-ны алу үшін CTAB әдісін де қолдануға болады.
Кәдімгі әдіс ретінде, екі бағанды әдіс қалыпты температуралық жұмысына, RNase қосудың қажеті жоқтығына және қауіпсіздігіне байланысты өте танымал - экстракция үшін хлороформ, фенолдар және басқа органикалық реагенттер жоқ.(ұсынылған өнімдер )
2. Жануарлар ұлпаларынан жалпы РНҚ алу
(1) Жаңа піскен матаны таңдап көріңіз, егер ол жаңа емес болса (үш ай ішінде жақсырақ - 80 ℃ тоңазытқышта немесе сұйық азотта мұздатылған. Тіндерді кесу кезінде бөлме температурасында тікелей кеспеңіз, оны мұз жәшігіне қоюды ұмытпаңыз, қайта-қайта мұздату мен ерітуге жол бермеңіз.
(2) Тіндердің кішкене бөлігін кесу үшін таза қайшы мен пинцетті пайдаланыңыз, үлгіні кесу кезінде тіннің орталық бөлігін кесіп көріңіз немесе алдымен ортасынан үлкен тін бөлігін кесіңіз, содан кейін үлгіні жаңа кесу орнында кесіңіз.Алынған тін толығымен ұсақталып, ұсақталған тіндерді RNase жоқ EP түтігіне салып, лизат қосып, ұсақталған тін лизатқа толығымен әсер етіп, гомогенизацияға дайындалуы керек.
(3) Қалыпты тіндер үшін гомогенизациялау үшін мош-бұршақ көлеміндегі тіндерді (30-60 мг) таңдаңыз.Егер тіндерде көп мөлшерде ақуыз, май немесе бауыр сияқты тығыз талшықты тіндер болса, кесілген тіндердің мөлшерін сәйкесінше көбейтіңіз немесе азайтыңыз (міндетті емес) 10~20 мг таңдаңыз).
(4) Егер балық бұлшықеті, асшаяндар еті, медузалар және құрамында суы жоғары басқа ұлпалар алынса, үлгі көлемін тиісті түрде көбейту керек (ұсынылатын 100-200 мг).
(5) Жағдайлар рұқсат етсе, жануарлардың тінін жоғары өтімді тіндердің гомогенизаторымен гомогенизациялаудан кейін, егер мұндай жабдық жоқ болса, тікелей экстракциялауға болады.
(6) Соңғы экстракциядан кейін алынған РНҚ РНҚ деградациясын азайту үшін дереу мұз жәшігіне салынуы керек.
3. Жануарлар жасушасының РНҚ экстракциясы
(1) Суспензия жасушалары: тікелей центрифугалаңыз және ортаны тастаңыз, стерильді PBS-пен 1-2 рет жуыңыз, содан кейін PBS-тің тиісті мөлшерімен суспензиялаңыз, содан кейін лизис үшін лизат қосыңыз.Лизатты сұйықтықты толығымен тастағаннан кейін тұндырылған жасушаларға тікелей қоспаңыз.Бұл сыртқы қабаттағы лизиске ұшыраған жасушалардан кейін босатылған гистон орамының тұндырылған жасушалардың сыртына жабысуына әкеледі, осылайша түйіршік ішіндегі жасушалардың лизатпен байланысын шектейді., нәтижесінде жасуша лизисі аяқталмайды және РНҚ шығымы төмендейді.
(2) Жартылай жабысқан немесе тығыз жабыспайтын жасушалар: Ортаны тастағаннан кейін PBS көмегімен 1-2 рет жуыңыз, содан кейін PBS-тің тиісті мөлшерін тікелей сіңіріңіз және жасушаларды үрлеу үшін пипеткамен немесе пистолетпен культуралық ыдысты үрлеңіз және оларды РНҚ-сыз жасушаларға тасымалдаңыз.Лизатты экстракция үшін ферменттің EP түтігіне қосыңыз.
(3) Жабысқан жасушалар: алдымен трипсинмен қорытылуы керек, содан кейін RNase жоқ EP түтіктеріне жиналады, үстіңгі затты кетіру үшін центрифугаланады, артық трипсинді кетіру үшін PBS-пен 1-2 рет жуылады және PBS тиісті мөлшерімен қайта суспензияланады Содан кейін экстракция қадамына өтіңіз.
4. Өсімдіктің РНҚ экстракциясы
Өсімдік ұлпалары фенолдық қосылыстарға бай немесе полисахаридтерге бай немесе кейбір анықталмаған екіншілік метаболиттерді қамтиды немесе RNase белсенділігі жоғары.Бұл заттар жасуша лизисінен кейін РНҚ-мен тығыз қосылып, ерімейтін комплекстер немесе коллоидты тұнбалар түзеді, оларды жою қиын.Сондықтан, біз өсімдік тінін шығарғанда, біз өсімдіктерге арналған жинақты таңдауымыз керек.Жинақтағы лизат полифенолдардың оңай тотығуы және полисахаридті қосылыстар мен нуклеин қышқылдарының бөлінуі мәселелерін тиімді шеше алады.
(Полисахаридті полифенол өсімдік РНҚ экстракциясы үшін ұсынылатын өнімдер:
(1) Өсімдіктің қабығы, целлюлозасы, тұқымдары, жапырақтары және т.б. толығымен ерітіндіде ұнтақталған болуы керек.Ұнтақтау процесінде үлгіні балқытпау үшін сұйық азотты уақытында толтыру керек.Ұнтақталған үлгіні лизатқа тез қосып, РНҚ деградациясын болдырмау үшін шайқау керек.
(2) Күріш пен бидай жапырақтары сияқты талшыққа бай үлгілер үшін экстракция көлемін тиісінше азайту керек, әйтпесе тіндердің ұнтақталуы және лизисі аяқталмайды, нәтижесінде алынған РНҚ төмен шығымдылығы болады.
(3) Анар жемісі, қарбыз жемісі, шабдалы жемісі және т.б. сияқты судың жоғары мөлшері бар өсімдік тіндері үшін үлгі өлшемін тиісті түрде арттыру керек (100-200 мг міндетті емес).
(4) Өсімдік жапырақтары, тамырсабақтары, қатты жемістер және басқа материалдар сияқты өсімдік ұлпаларына әдетте ерітіндідегі ингредиенттерді мұқият ерітінділеу үшін сұйық азотты пайдалану ұсынылады, содан кейін экстракция кезеңіне өтіңіз.Кәдімгі тін гомогенизаторлары өсімдік тіндерін гомогенизациялауда тиімді болмауы мүмкін және әдетте ұсынылмайды.
5. РНҚ экстракциясы кезіндегі сақтық шаралары
(1) Қайта мұздату мен ерітуді болдырмау үшін тін үлгілері мүмкіндігінше жаңа болуы керек.
(2) Экстракция кезінде тін толығымен ұнтақталған болуы керек және тіндердің мөлшері тым көп емес, тым аз болмауы керек.
(3) Үлгіні толығымен лизисі үшін лизат қосқаннан кейін жеткілікті инкубация уақыты берілуі керек.
(4) Экстракция үшін Тризол әдісін пайдаланған кезде, стратификациядан кейін үстіңгі затты сіңіру принципі «көбірек дем алудан гөрі аз дем алуды ұнатады» және ортаңғы қабатқа экстракциялауға болмайды, әйтпесе ол ауыр геномдық ДНҚ ластануын тудырады.
(5) Жуу кезінде мұқият жууды қамтамасыз ету үшін жуу сұйықтығы түтік қабырғасының айналасына толығымен инфильтрациялануы керек.
(6) Колонканы экстракциялау әдісі үшін жуудан кейін колонканы ажыратудан басқа, адсорбциялық колонканы да өте таза орындыққа қойып, органикалық еріткіштің кебуіне дейін толығымен буландыру үшін 5-10 минут үрлеу керек.
(7) Колонна әдісінің соңғы элюциясы кезінде DEPC суын қосқаннан кейін оны 3-5 минут инкубациялау керек немесе элюция шығымын арттыру үшін DEPC суын алдын ала 60°C дейін қыздыру керек.Дәстүрлі Тризолды бөлу және изопропанолды тұндыру әдісінде соңғы РНҚ DEPC суында ерітіледі, сондықтан ерітуге тиісті уақыт беріліп, центрифуга түтігінің түбін тамшуыр ұшымен үздіксіз үрлеу керек.
3 ТТөмен РНҚ концентрациясының/төмен сапаның себептері мен шешімдері
1. Өнімділік тым төмен
Алынған үлгі тым төмен, жалпы сома жеткіліксіз немесе алынған үлгі тым көп және лизис аяқталмаған;экстракция үшін тиісті сападағы тін немесе жасушалар пайдаланылуы керек, үлгіні алдын ала өңдеу жақсы жүргізілуі керек және лизис жеткілікті болуы керек.
2. Геном қалдықтары
Тризол әдісімен экстракциялау кезінде үстіңгі қабат қабатталғаннан кейін ортаңғы қабатқа сорылған кезде геномның ауыр ластануы туындайды;ортаңғы қабатқа сорып алмау үшін қабаттастыру кезінде ерекше сақтық таныту керек.Егер экстракция үшін баған әдісі пайдаланылса, экстракция үшін DNase I бар жинақ таңдалуы мүмкін.Мембранада адсорбцияланған нуклеин қышқылы DNase I-мен тікелей қорытылады, ол ДНҚ қалдықтарын айтарлықтай азайтады.
3. РНҚ деградациясы
Бұл экстракцияланған үлгінің өзінің деградациясы немесе экстракция процесінде туындаған деградация болуы мүмкін;мүмкіндігінше, РНҚ экстракциясы үшін жаңа үлгілерді пайдалану керек және жиналған үлгілерді сұйық азотта немесе -80°C тоңазытқышта уақытында сақтау керек және қайталанатын мұздату мен ерітуге жол бермеу керек.РНҚ экстракциясы процесінде RNase/DNase бос ұштарды, центрифуга түтіктерін және басқа материалдарды пайдалану керек.Экстракция процесі мүмкіндігінше жылдам болуы керек.Алынған РНҚ мұз жәшігіне салынып, уақытында -80 температурада сақталуы керек.Егер экстракцияланған РНҚ-ны гельдік электрофорез арқылы анықтау қажет болса, экстракциядан кейін бірден электрофорез жүргізу керек, ал электрофорез буферін жаңадан дайындалғанымен ауыстыру керек.
4. Тұз және органикалық еріткіш қалдықтары
Экстракциялық реагенттерде фенол және гуанидин тұздары, ал жуу ерітіндісінде этанол бар.Экстракция процесінде лизат толығымен сіңірілмеді және жойылды, ал жуу ерітіндісі толық кептірілмеген.Қалдық тұздар мен органикалық еріткіштер кейінгі кері транскрипция мен ПТР үшін зиянды.Ингибирлеудің әртүрлі дәрежелері, сондықтан экстракция процесінде тіндік лизат толығымен жойылуы керек және түтіктің айналасындағы қабырғаларды жууға болатындай жуу жеткілікті болуы керек.Сонымен қатар, түтік босатылып, үрлеу органикалық заттардың қалдықтарын одан әрі азайтатын қажетті қадам болып табылады.
РНҚ экстракциясы туралы қосымша ақпарат алу үшін біздің веб-сайтты орындаңыз:
Қосымша ақпарат алу үшін www.foreivd.com.
Жіберу уақыты: 01 желтоқсан 2022 ж
