• facebook
  • linkedin
  • youtube

Молекулярлық диагностика технологиясы ауруларды болжау және диагностикалау мақсатына жету үшін адам ағзасының және әртүрлі патогендердің генетикалық материалының көрінісі мен құрылымын анықтау үшін молекулалық биология әдістерін қолданады.

Соңғы жылдары молекулярлық диагностика технологиясының жаңаруымен және қайталануымен молекулярлық диагностиканың клиникалық қолданылуы барған сайын кеңейіп, тереңдеді және молекулалық диагностика нарығы қарқынды даму кезеңіне енді.

Автор нарықтағы кең таралған молекулалық диагностикалық технологияларды қорытындылайды және үш бөлікке бөлінеді: бірінші бөлімде ПТР технологиясы, екінші бөлімде нуклеин қышқылының изотермиялық күшейту технологиясы, екінші бөлімде секвенирлеу технологиясы.

01

I бөлім: ПТР технологиясы

ПТР технологиясы

ПТР (полимеразды тізбекті реакция) – 30 жылдан астам тарихы бар, in vitro ДНҚ күшейту технологияларының бірі.

ПТР технологиясын 1983 жылы АҚШ-тың Цетус тұрғыны Кари Муллис енгізді.Муллис 1985 жылы ПТР патентіне өтініш берді және сол жылы Ғылым туралы алғашқы ПТР академиялық мақаласын жариялады.Маллис 1993 жылы химия бойынша Нобель сыйлығын жеңіп алды.

ПТР негізгі принциптері

ПТР мақсатты ДНҚ фрагменттерін миллионнан астам есе күшейте алады.Бұл принцип ДНҚ-полимераза катализінде ДНҚ-ның негізгі тізбегі үлгі ретінде пайдаланылады, ал кеңейту үшін бастапқы нүкте ретінде белгілі бір праймер қолданылады.Ол денатурация, жасыту және ұзарту сияқты қадамдар арқылы in vitro репликацияланады.ДНҚ-ның аналық тізбек шаблонына комплементарлы аналық тізбектің ДНҚ процесі.

1

Стандартты ПТР процесі үш кезеңге бөлінеді:

1. Денатурация: ДНҚ қос тізбектерін бөлу үшін жоғары температураны пайдаланыңыз.ДНҚ қос тізбектері арасындағы сутектік байланыстар жоғары температурада (93-98°С) үзіледі.

2. Жасыту: қос тізбекті ДНҚ бөлінгеннен кейін, праймер бір тізбекті ДНҚ-мен байланыса алатындай температура төмендетіледі.

3. Кеңейту: ДНҚ-полимераза температура төмендеген кезде байланыстырылған праймерлерден ДНҚ тізбектері бойымен комплементарлы тізбектерді синтездей бастайды.Кеңейту аяқталған кезде цикл аяқталады және ДНҚ фрагменттерінің саны екі есе артады.

Осы үш қадамды 25-35 рет қайталаса, ДНҚ фрагменттерінің саны экспоненциалды түрде артады.

2

ПТР-ның тапқырлығы - әртүрлі мақсатты гендер үшін әртүрлі праймерлерді құрастыруға болады, осылайша мақсатты ген фрагменттерін қысқа уақыт ішінде күшейтуге болады.

Әзірге ПТР үш санатқа бөлуге болады, атап айтқанда қарапайым ПТР, флуоресцентті сандық ПТР және цифрлық ПТР.

Қарапайым ПТР бірінші буыны

Мақсатты генді күшейту үшін кәдімгі ПТР күшейту құралын пайдаланыңыз, содан кейін өнімді анықтау үшін агарозды гель электрофорезін пайдаланыңыз, тек сапалы талдау жасауға болады.

Бірінші буын ПТР негізгі кемшіліктері:

-Спецификалық емес күшейтуге және жалған оң нәтижелерге бейім.

-Анықтау ұзаққа созылады және операция ауыр.

- Тек сапалы тестілеуге болады.

Екінші буынның флуоресцентті сандық ПТР

Флуоресценциялық сандық ПТР (нақты уақыттағы ПТР), qPCR деп те аталады, реакция жүйесінің барысын көрсете алатын флуоресцентті зондтарды қосу арқылы флуоресцентті сигналдарды жинақтау арқылы күшейтілген өнімдердің жинақталуын бақылау үшін және флуоресценция қисығы арқылы нәтижелерді бағалау үшін пайдаланылады және оны CQ және стандартты қисық мәннің көмегімен анықтауға болады.

qPCR технологиясы жабық жүйеде жүзеге асырылатындықтан, ластану ықтималдығы төмендейді және сандық анықтау үшін флуоресценттік сигналды бақылауға болады, сондықтан ол клиникалық тәжірибеде ең кең таралған және ПТР-де басым технологияға айналды.

Нақты уақыттағы флуоресцентті сандық ПТР кезінде қолданылатын флуоресцентті заттарды мыналарға бөлуге болады: TaqMan флуоресцентті зондтары, молекулалық маяктар және флуоресцентті бояғыштар.

1) TaqMan флуоресцентті зонд:

ПТР күшейту кезінде жұп праймерлерді қосу кезінде арнайы флуоресцентті зонд қосылады.Зонд олигонуклеотид болып табылады және екі ұшы сәйкесінше репортер флуоресценттік тобымен және сөндіруші флуоресцентті топпен белгіленген.

Зонд бүтін болған кезде репортер тобы шығаратын флуоресцентті сигналды сөндіру тобы жұтады;ПТР күшейту кезінде Taq ферментінің 5′-3′ экзонуклеаза белсенділігі зондты ыдыратады және ыдыратады, бұл флуоресцентті топты ажыратады, осылайша флуоресцентті бақылау жүйесі флуоресценция сигналын қабылдай алады, яғни ДНҚ тізбегі күшейген сайын, тұмау немесе флюоресцентті мойынтұмсық пайда болады, сигнал ПТР өнімінің қалыптасуымен толығымен синхрондалады.

2) SYBR флуоресцентті бояғыштар:

ПТР реакция жүйесінде SYBR флуоресцентті бояудың артық мөлшері қосылады.SYBR флуоресцентті бояу ДНҚ қос тізбегіне спецификалық емес түрде енгізілгеннен кейін ол флуоресцентті сигнал шығарады.Тізбекке қосылмаған SYBR бояғыш молекуласы флуоресцентті сигналды шығармайды, осылайша флуоресцентті сигналды қамтамасыз етеді ПТР өнімдерінің көбеюі ПТР өнімдерінің ұлғаюымен толығымен синхрондалады.SYBR тек қос тізбекті ДНҚ-мен байланысады, сондықтан балқу қисығын ПТР реакциясының спецификалық екенін анықтау үшін пайдалануға болады.

3 4

3) Молекулярлық маяктар

Бұл 5 және 3 ұштарында шамамен 8 негізден тұратын шаш қыстырғыш құрылымын құрайтын екі таңбалы олигонуклеотидті ілмекті зонд.Нуклеин қышқылдарының екі жағындағы тізбегі қосымша түрде жұптастырылған, бұл флуоресцентті топ пен сөндіру тобының тығыз болуына әкеледі.Жабыңыз, ол флуоресценцияны шығармайды.

5

ПТР өнімі жасалғаннан кейін, жасыту процесі кезінде молекулалық маяктың ортаңғы бөлігі белгілі бір ДНҚ тізбегімен жұптастырылады, ал флуоресцентті ген флуоресценция алу үшін сөндіруші геннен бөлінеді.

6

Екінші буындағы ПТР негізгі кемшіліктері:

Сезімталдық әлі де жетіспейді және аз көшірме үлгілерді анықтау дәл емес.

Фондық мәннің әсері бар және нәтиже кедергіге бейім.

Үшінші буын цифрлық ПТР

Сандық ПТР (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) түпкілікті нүктені анықтау арқылы мақсатты тізбектің көшірме нөмірін есептейді және ішкі басқару элементтерін және стандартты қисықтарды пайдаланбай дәл абсолютті сандық анықтауды орындай алады.

Цифрлық ПТР соңғы нүктені анықтауды пайдаланады және Ct мәніне (цикл шегі) тәуелді емес, сондықтан сандық ПТР реакциясына күшейту тиімділігі аз әсер етеді, ал ПТР реакция ингибиторларына төзімділік жоғары дәлдікпен және қайталану мүмкіндігімен жақсарады.

Жоғары сезімталдық пен жоғары дәлдік сипаттамаларының арқасында оған ПТР реакция ингибиторлары оңай араласпайды және ол стандартты өнімдерсіз шынайы абсолютті сандық анықтауға қол жеткізе алады, бұл зерттеу мен қолданудың ыстық нүктесіне айналды.

Реакция бірлігінің әртүрлі формалары бойынша оны үш түрге бөлуге болады: микрофлюидтік, чиптік және тамшылық жүйелер.


Жіберу уақыты: 08 шілде 2021 ж