Флуоресценциялық сандық ПТР (сонымен қатар TaqMan ПТР, бұдан әрі FQ-ПТР деп аталады) 1995 жылы Америка Құрама Штаттарында PE (Перкин Элмер) әзірлеген нуклеин қышқылының жаңа сандық технологиясы болып табылады. Бұл технология флуоресцентті таңбаланған зондтарды қосу арқылы кәдімгі ПТР-ға негізделген.Икемді ПТР-мен салыстырғанда, FQ-ПТР өзінің сандық функциясын жүзеге асыру үшін көптеген артықшылықтарға ие.Бұл мақала технологияның сипаттамаларын, принциптерін, әдістерін және қолдануларын қысқаша сипаттауды көздейді.
1 Мүмкіндіктер
FQ-ПТР қарапайым ПТР-дың жоғары сезімталдығына ие ғана емес, сонымен қатар флуоресцентті зондтарды қолданудың арқасында сандық нәтижелерді алу үшін фотоэлектрлік өткізгіштік жүйесі арқылы ПТР күшейту кезінде флуоресцентті сигналдың өзгеруін тікелей анықтай алады, бұл әдеттегі ПТР көптеген кемшіліктерін жояды, сондықтан ол сонымен қатар ДНҚ-ның жоғары спецификалылығы мен жоғары спецификалылығы бар.
Мысалы, жалпы ПТР өнімдерін агарозды гель электрофорезі және этидий бромиді ультракүлгін сәулемен бояу немесе полиакриламидті гель электрофорезі және күміс бояуы арқылы бақылау қажет.Бұл бірнеше құралдарды ғана емес, сонымен қатар уақыт пен күш-жігерді де қажет етеді.Этидий бромиді қолданылған дақтар адам ағзасына зиянды және бұл күрделі эксперименттік процедуралар ластану мен жалған позитивтерге мүмкіндік береді.Дегенмен, FQ-PCR үлгіні жүктеу кезінде қақпақты бір рет ашу керек, ал келесі процесс толығымен жабық түтікпен жұмыс істейді, бұл ПТР кейінгі өңдеуді қажет етпейді, әдеттегі ПТР операцияларында көптеген кемшіліктерді болдырмайды.Эксперимент әдетте PE компаниясы әзірлеген ABI7100 ПТР термиялық циклін пайдаланады.
Құралдың келесі сипаттамалары бар: ① Кең қолдану: Оны ДНҚ және РНҚ ПТР өнімін сандық анықтау, ген экспрессиясын зерттеу, патогенді анықтау және ПТР шарттарын оңтайландыру үшін пайдалануға болады.② Бірегей сандық принцип: флуоресцентті таңбаланған зондтарды пайдалану арқылы флуоресценция мөлшері сандық анықтау мақсатына жету үшін лазерлік қозудан кейін ПТР циклімен бірге жинақталады.③ Жоғары жұмыс тиімділігі: Кірістірілген 9600 ПТР термиялық циклі, 96 үлгіні автоматты түрде және синхронды түрде күшейту және сандық анықтауды аяқтау үшін компьютер 1-2 сағат басқарылады.④ Гель электрофорезінің қажеті жоқ: үлгіні сұйылту және электрофорездеу қажет емес, реакция түтігінде тікелей анықтау үшін арнайы зондты пайдаланыңыз.⑤Құбырда ластану жоқ: бірегей толығымен жабық реакция түтігі және фотоэлектрлік өткізгіштік жүйесі қабылданған, сондықтан ластану туралы алаңдаудың қажеті жоқ.⑥Нәтижелер қайталануы мүмкін: сандық динамикалық диапазон магнитуданың бес ретіне дейін.Сондықтан бұл технология сәтті жасалғаннан бері көптеген ғылыми зерттеушілер тарапынан бағаланып, көптеген салаларда қолданыла бастады.
2 Принциптер мен әдістер
FQ-ПТР жұмыс принципі ПТР реакция жүйесіне флуоресцентті таңбаланған зонд қосу үшін Taq ферментінің 5′→3′ экзонуклеаза белсенділігін пайдалану болып табылады.Зонд праймер тізбегіндегі ДНҚ үлгісімен арнайы будандаса алады.Зондтың 5′ ұшы FAM (6-карбоксифлуоресцеин, флуоресценция шығарылымының шыңы 518 нм) флуоресценциялық эмиссия генімен, ал 3′ ұшы флуоресценцияны сөндіру тобы TAMRA (6-карбокситетраметилродамин, флюоресценция 38 нм) таңбасымен белгіленген. ПТР күшейту кезінде зондтың ұзартылуын болдырмау үшін фосфорланған.Зонд бүтін болған кезде, сөндіргіш тобы сәуле шығарушы топтың флуоресценттік сәулеленуін басады.Эмитенттік топ сөндіргіш топтан бөлінгеннен кейін, тежеу жойылады және 518 нм-дегі оптикалық тығыздық артады және флуоресценцияны анықтау жүйесі арқылы анықталады. Ренатурация фазасында зонд ДНҚ шаблонымен гибридтенеді, ал ұзарту фазасындағы Taq ферменті ДНҚ темпінің ұзартқышымен бірге қозғалады.Зондты кесіп тастағанда, сөндіру әсері және флуоресцентті сигнал шығарылады.Үлгі көшірілген сайын флуоресцентті сигналдың шығарылуымен бірге зонд кесіледі.Шығарылған флюорофорлар саны мен ПТР өнімдерінің саны арасында бір-бірден байланыс болғандықтан, бұл әдісті үлгіні дәл анықтау үшін пайдалануға болады.Эксперименттік құрал әдетте PE компаниясы әзірлеген ABI7100 ПТР термиялық циклін пайдаланады және басқа термиялық циклерлер де пайдаланылуы мүмкін.Егер эксперимент үшін ABI7700 реакция типті реакция жүйесі пайдаланылса, реакция аяқталғаннан кейін сандық нәтижелерді компьютерлік талдау арқылы тікелей беруге болады.Басқа термиялық циклерлерді пайдалансаңыз, RQ+, RQ-, △RQ есептеу үшін бір уақытта реакция түтігіндегі флуоресценция сигналын өлшеу үшін флуоресценция детекторын пайдалану керек.RQ+ үлгі түтігінің флуоресценттік эмиссия тобының люминесценция қарқындылығының сөндіру тобының люминесценция қарқындылығына қатынасын білдіреді, RQ- бос түтіктегі екеуінің қатынасын білдіреді, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) флуоресценттік процесс кезінде алынған деректердің флуоресцентті өзгеруінен кейін алынған деректердің көлемін білдіреді.Флуоресцентті зондтардың енгізілуіне байланысты тәжірибенің ерекшелігі айтарлықтай жақсарды.Зонд конструкциясы әдетте келесі шарттарға сай болуы керек: ①Байланыстыру ерекшелігін қамтамасыз ету үшін зондтың ұзындығы шамамен 20-40 негіз болуы керек.②Бір нуклеотидті тізбектердің қайталануын болдырмау үшін GC негіздерінің мазмұны 40% және 60% арасында.③ Гибридизацияны болдырмаңыз немесе праймерлермен қабаттасыңыз.④ Зонд пен үлгі арасындағы байланыстыру тұрақтылығы праймер мен үлгі арасындағы байланыстыру тұрақтылығынан жоғары, сондықтан зондтың Tm мәні праймердің Tm мәнінен кемінде 5°C жоғары болуы керек.Бұған қоса, зондтың концентрациясы, зонд пен шаблон тізбегі арасындағы гомология және зонд пен праймер арасындағы қашықтық эксперимент нәтижелеріне әсер етеді.
Қосымша тауарлар:
Қытай нақты уақыттағы ПТР Easyᵀᴹ-Taqman өндіруші және жеткізуші |Foregene (foreivd.com)
Жіберу уақыты: 15 қазан 2021 ж
