RNase - бұл РНҚ экстракция эксперименттерін жиі жүргізетін көптеген студенттер естігісі келмейтін сезімтал сөз.Толық қаруланған РНҚ, ақырында өте улы реагенттер фенол мен хлороформмен экстракцияланған.Мен татуласпаймын!!!Бүгін атақты Рнасенің шығу тегін қарастырайық.

Рибонуклеаза (RNase) немесе RNase - бұл РНҚ-ны кіші молекулаларға гидролиздейтін нуклеаза.RNase шағын молекулалы ақуыз ретінде әдеттен тыс тұрақты .Кәдімгі жоғары температура мен жоғары қысымды бумен зарарсыздандыру және ақуыз ингибиторлары оны толығымен инактивациялай алмайды.RNase тұрақтылығы негізінен құрылымдағы дисульфидті байланыстардан туындайды.Мысалы, сиырдың ұйқы безінің жиі қолданылатын RNase құрамында 124 аминқышқылы бар, бірақ құрамында 4 дисульфидтік байланыс бар.Күкірт байланысы және дисульфидтік байланыс RNase-ге тамаша термиялық тұрақтылық береді.Сонымен қатар, рназа салыстырмалы түрде шағын молекулалық массаға ие және көптеген жағдайларда өзінің бастапқы конформациясын тез қалпына келтіре алады.

Өте тұрақты болудан басқа,RNase зертханада барлық жерде кездеседі .RNase - биологиялық қорғаныс механизмі.Жасуша үшін экзогендік РНҚ көбінесе өлімге әкеледі.Экзогендік ДНҚ-мен салыстырғанда, экзогендік РНҚ жиі қауіптірек.РНҚ бақытты түрде транскрипцияланады және аударылады, сондықтан барлық дерлік организмдер экзогендік РНҚ инвазиясынан қорғану үшін РНҚ-ны дамытты.Сондықтан зертханада өсірілген бактерия жасушалары және сіз РНҚ-ны шығаратын болсаңыз, RNase хош иісін шығарады.Адам ағзасының сұйықтықтарында (сілекей, көз жасы және т.б.) көп мөлшерде RNase бар, сондықтан РНҚ бұзылған кезде жыламаңыз.Сіз неғұрлым көп жыласаңыз, соғұрлым РНҚ деградациясы нашарлайды!!Дайю апа РНҚ алу үшін жарамайды!

Бұған қоса, нәзік теріңізде RNase көп және тері тиген маркерлерде, тамшуырларда, тоңазытқыш есіктерінде және есік тұтқаларында да RNase бар.

Осыншама шатасумен RNases-пен қалай күресуге болатынын қарастырайық.

РНҚ-ны жою кезінде әркім ойлайтын бірінші нәрсеDEPC(диэтил пирокарбонат).DEPC негізінен гистидиннің RNase белсенді тобының имидазол сақинасымен біріктіру арқылы ақуызды денатурациялайды, осылайша ферменттің белсенділігін тежейді.0,1% DEPC Rnase-ге жақсырақ кетіру әсері болуы мүмкін, бірақ біз DEPC белгілі канцероген екеніне назар аударуымыз керек, сондықтан оны пайдалану кезінде ерекше назар аудару керек.

RNase үшін біз екі аспектіден бастауымыз керек:біріншісі - эндогендік RNase белсенділігін тежеу

Тризол құрамындағы гуанидин-изотиоцианат және DTT сияқты кәдімгі РНҚ экстракциялық реагенттер RNase дисульфидтік байланысын аша алады, бірақ әлі де кейбір RNase бар, әсіресе тін үлгілерінде, сондықтан төмен температураға назар аударыңыз.

1.Тін үлгісін шығарғаннан кейін бірден сұйық азотқа немесе коммерциялық РНҚ-ны сақтау ерітіндісіне батырыңыз.

2.Жасуша үлгісінің РНҚ-сын бөліп алғаннан кейін оны лизис ерітіндісіне қосып, мұз қорапшасында лизис жасаңыз.

3. Ұнтақтау үшін сұйық азотты қолданған дұрыс ұлпа үлгілері гомогенизацияланғанда.Сұйық азотсыз электрлік гомогенизаторды пайдаланған кезде гомогенат адаптерін толығымен алдын ала суытуға назар аударыңыз.

Екіншісі - экзогендік DNase

1.Толық қаруланыңыз, зертханалық халатты киіңіз, бетперде киіңіз және міндетті түрде жаңа қолғап киіңіз (соншалықты үнемді болмаңыз! Айта кету керек, Тризол өте коррозияға ұшырайды, сонымен қатар ол қолғап арқылы өте күшті, сондықтан қолыңызға тамшылатпаңыз).

2.Пайдаланылған тамшуырлардың барлық ұштары, EP түтіктері, ПТР түтіктері және басқа жабдық де-RNase өңделуі керек.Оны 0,1% DEPC-ге малып, содан кейін жоғары қысыммен қысымға түсіруге болады.Сорғыштағы жұмысқа назар аударыңыз.Жергілікті тирандар ферменттерді жоюға арналған шығын материалдарын тікелей сатып ала алады.

PS: Сізге жалқау әдіс айтып берейін.Жоғары температура мен жоғары қысым RNase-ны толығымен жоя алмаса да, оның үлкен бөлігін жояды.2 рет жоғары температура мен жоғары қысым жақсы әсер етеді, ал РНҚ экстракциясы аз әсер етеді.

3.Алкоголь белоктарды денатурациялай алады,сондықтан РНҚ экстракция кестесін 75% спиртпен сүртуге болады , және қолғапты спиртпен шашуға да болады.

4.Соңғы РНҚ ерітетін ерітінді мен центрифуга түтігін де-РНазды өңдеу керек.DEPC суы жиі қолданылатын РНҚ ерітетін ерітінді болып табылады.DEPC суын дұрыс дайындау әдісі туралы сөйлесейік (сатып алған кезде коммерциялық DEPC-ті қайта орауды ұмытпаңыз)

1:1000 ультра таза суға DEPC қосыңыз, жақсылап шайқаңыз, 37 ° C температурада түнде қалдырыңыз және 121 ° C жоғары температурада және жоғары қысымда 15 минут бойы зарарсыздандырыңыз.DEPC суын -20°C температурада 1 мл аликвотта сақтауға болады.

Қорытындылай келе: төмен температура - бұл кілт, шығын материалдары жақсы өңделеді, толық қаруланған және аз сөйлеседі!

Міне, бүгінгі стратегия үшін де солай.Сізге барлық РНҚ концентрациясы мен сіз айтқан тазалықты тілеймін.A260/A280 екеуі де 2.0!!!

Әрине, егер сіз абөлме температурасында жұмыс істейтін РНҚ экстракция жинағы, жоғарыда көрсетілген қиындықтарға тап болмауыңыз мүмкін.

Бөлме температурасындағы операция, DNase қоспай, 11 минут ішінде жасушалардан жалпы РНҚ-ны бөліп алады және 30 минут ішінде жануарлардың ұлпаларынан немесе өсімдіктерден жалпы РНҚ-ны шығарады.

Сынақ үлгілерін алу үшін хабарласыңыз:overseas@foregene.com

Қосымша тауарлар:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/