Тікелей ПТР - бұл нуклеин қышқылын экстракциясыз күшейту үшін жануарлар немесе өсімдік тіндерін тікелей пайдаланатын реакция.Көптеген жолдармен тікелей ПТР әдеттегі ПТР сияқты жұмыс істейді

Негізгі айырмашылық тікелей ПТР-да қолданылатын тапсырыстық буфер, үлгіні нуклеин қышқылын экстракциясыз тікелей ПТР реакциясына түсіруге болады, бірақ тікелей ПТР реакциясына қатысатын ферменттердің төзімділігіне және буфердің үйлесімділігіне сәйкес талаптар бар.

Жалпы үлгілерде ПТР ингибиторлары көп немесе аз болса да, тікелей ПТР әлі де ферменттер мен буферлердің әсерінен сенімді күшейтуге қол жеткізе алады.Дәстүрлі ПТР реакциясы үлгі ретінде жоғары сапалы нуклеин қышқылын қажет етеді, егер үлгіде ақуыздар мен басқа қоспалар болса, ПТР реакциясының бірқалыпты жүруін тежей алады.Қазіргі уақытта тікелей ПТР молекулалық диагностика саласындағы ең танымал технологиялардың бірі болып табылады.

01 Тікелей ПТР бастапқыда жануарлар мен өсімдіктер үшін қолданылған

Тікелей ПТР ең ерте қолдану жануарлар мен өсімдіктер саласында, мысалы, егеуқұйрықтың, мысықтың, тауықтың, қоянның, қойдың, ірі қараның және т.б. қан, ұлпа мен жүн, өсімдік жапырақтары мен тұқымдары және т.б., генотиптеуді, трансгенді, плазмидтерді анықтауды, гендік нокаутты талдауды, ДНҚ көзін анықтауды, түрлерді анықтауды және басқа салаларда қолданылады.

Бұл өрістердің кейбір ортақ ерекшеліктері бар, яғни мақсатты геннің құрамы салыстырмалы түрде жоғары және нуклеин қышқылының экстракциясы қиындық туғызады, сондықтан тікелей ПТР уақытты үнемдеп, нәтижеге аз ғана әсер етіп қана қоймай, сонымен қатар шығындарды да үнемдей алады.

Патогенді анықтау үшін қолданылатын тікелей ПТР соңғы жылдардағы мәселе болып табылады, кейбір ПТР реагент өндірушілері инновациялар жасау кезінде осы бағытта көп күш жұмсады.Әсіресе осы COVID-19 індетінде нарықта осындай көптеген анықтау өнімдері пайда болды, мысалы, SARS-CoV-2 нуклеин қышқылын анықтау жинағы (Мультиплексті ПТР флуоресцентті зонд әдісі) адамда қышқыл-қышқылды немесе қышқыл-қышқылды вирусты сапалы анықтау үшін нақты уақыттағы RT ПТР технологиясын (rRT-PCR) қолданатын Foregene зерттеген және әзірлеген. гарингальды жағынды үлгілері.

Foregene қалыпты ORF1ab, N, E және анықтау үшін Direct PCR технологиясын қолданатын компаниялардың бірі болып табылады.нұсқа SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (Ұлыбритания), B.1.351 lineage (ZA), B.1.617 lineage (IND) және P.1 lineage (BR) сияқты адамның мұрын-жұтқыншақ немесе орофарингеальды жағынды үлгілеріндегі нуклеин қышқылдарының линиялары.

02  Тікелей ПТР үшін қажетті реагенттер

Лизат үлгісі

Лизат үлгісін өзіңіз конфигурациялауға немесе сатып алуға болады.Лизаттың әртүрлі маркаларының құрамындағы айырмашылық лизистік қабілетті басқаша етеді, содан кейін лизистік уақыт аздап басқаша болады.Мысалы, жануарлар тінінің үлгілерін дайындау үшін әдетте 30 минут немесе түнде лизис ұсынылады, ал вирустар үшін лизис ерітіндісі 3-10 минут аралығында болады.

ПТР негізгі қоспасы

Арнайы күшейтуді күшейту және күшейту қабілетін арттыру үшін ыстық басталатын ДНҚ-полимеразаны қолдану ұсынылады.Тікелей ПТР өзегі жоғары төзімді полимераза болып табылады.

Үлгідегі ДНҚ күшейтуіне әсер ететін компоненттерді жою немесе тежеу

Үлгі лизатпен өңделгеннен кейін белоктар, липидтер және басқа жасуша қалдықтары бөлінеді, бұл заттар ПТР реакциясын тежейді.Сондықтан тікелей ПТР осы факторлардың әсерін азайту үшін сәйкес жоюды немесе ингибиторларды қосуды талап етеді.

03  Тікелей ПТР бес білім нүктесінің жинағы

Біріншіден, Direct PCR технологиясы әртүрлі биологиялық үлгілер үшін тікелей ПТР технологиясы болып табылады.Бұл техникалық жағдайда ПТР реакциясын орындау үшін нуклеин қышқылын бөліп алу және экстракциялау, тін үлгісін объект ретінде тікелей пайдалану және мақсатты гендік праймерлерді қосу қажет емес.

Екіншіден, Direct ПТР технологиясы дәстүрлі ДНҚ үлгісін күшейту технологиясы ғана емес, сонымен қатар РНҚ шаблонының кері транскрипциясы ПТР кіреді.

Үшіншіден, Тікелей ПТР технологиясы тін үлгілерінде әдеттегі сапалы ПТР реакцияларын тікелей орындап қана қоймайды, сонымен қатар реакция жүйесінің күшті антифондық флуоресценция кедергі мүмкіндігін және эндогендік флуоресценцияның антагонистік қабілеттерін өшіретінін талап ететін Real-Time qPCR реакцияларын қамтиды.

Төртіншіден, Тікелей ПТР технологиясымен бағытталған үлгілер тек нуклеин қышқылы үлгілерін шығаруды қажет етеді және ПТР реакциясына кедергі келтіретін ақуыздарды, полисахаридтерді, тұз иондарын және т.б. алып тастамайды.Бұл реакция жүйесіндегі нуклеин қышқылы полимеразасы мен ПТР қоспасының күрделі жағдайларда ферменттердің белсенділігі мен репликация дәлдігін қамтамасыз ету үшін тамаша төзімділік пен бейімделгіштікке ие болуын талап етеді.

Бесіншіден, нуклеин қышқылын байыту өңдеусіз тікелей ПТР технологиясымен бағытталған тін үлгісі және шаблон мөлшері өте аз, бұл реакция жүйесінде өте жоғары сезімталдық пен күшейту тиімділігін талап етеді.