Тазалау бағанасы бітеліп қалған

Бұл жинақта геномдық ДНҚ экстракциясы операциясында тазарту бағанасы центрифугалау қадамынсыз үлгінің ферментативті лизисі қоспасына тікелей адсорбцияланады және тазарту бағанасы толық ферменттелмегендіктен және үлгінің жоғары тұтқырлығына байланысты бітеліп қалуы мүмкін.

Келесі ықтимал себептер келесідей:

1. Ұлпа үлгілерінің толық емес ферментативті қорытылуы.

Ұсыныс: Foregene Protease үлгісін өңдеу уақыты сәйкесінше ұзартылуы мүмкін немесе үстіңгі затты 12 000 айн/мин (~13 400 × г) 5 минут бойы центрифугалаудан кейін алуға болады.

2. Тін үлгілерін немесе үлкен тіндерді шамадан тыс пайдалану.

Ұсыныс: Үлгідегі 1 Буккал тампонынан аспаған дұрыс;егер үлгі тым үлкен болса, ST1 Buffer, Foregene Protease, ST2 буферінің дозасын тиісінше арттырыңыз.

3. Үлгі тұтқырлығы тым жоғары.

Ұсыныс: геномдық ДНҚ экстракциясы алдында үлгілерді 10 мМ Tris-HCl-мен тиісті түрде сұйылтуға болады.

4. Қан картасының фрагменттері сорылған.

Ұсыныс: геномдық экстракцияның (FTA Card) 6-қадамының өтпелі центрифугалау уақыты сәйкесінше ұзартылуы мүмкін.

Төмен өнімділік немесе ДНҚ жоқ

Көбінесе геномдық ДНҚ шығымына әсер ететін әртүрлі факторлар, соның ішінде үлгінің шығу тегі, үлгіні сақтау шарттары, үлгіні дайындау, манипуляция және т.б.

Экстракция кезінде геномдық ДНҚ алынбайды

Ықтимал себептер келесідей:

1. Үлгілерді дұрыс сақтамау немесе тым ұзақ сақтау геномдық ДНҚ деградациясына әкеледі.

Ұсыныс: Ауызша жағындыларды жаңадан сынаған дұрыс және геномдық ДНҚ экстракциялау операциялары үшін сақталған жағындыларды пайдалану ұсынылмайды;қан дақтарының үлгілері сапасының сәйкестігін және сақтау уақыты тым ұзақ болмауын қамтамасыз етуі керек.

2. Тіндерді тым аз қолдану сәйкес геномдық ДНҚ экстракциясына әкелмейді.

Ұсыныс: Операция нұсқаулығындағы ауыз қуысынан жағынды сынама алу нұсқауларын орындаңыз және геномдық ДНҚ экстракциясы үшін ауызша жағындыға жеткілікті жасушалар бекітілуі үшін мүмкіндігінше көп рет сүртіңіз;қан дақ үлгісін алу үшін қан дақтарын кесу аймағын сәйкесінше үлкейтуге болады.

3. Foregene Protease дұрыс сақталмаған, нәтижесінде оның белсенділігі төмендейді немесе инактивацияланады.

Ұсыныс: Foregene Protease сақтау шарттарын растаңыз немесе оны ферментативті реакцияға арналған жаңа Foregene Protease-мен ауыстырыңыз.

4. Жинақтың дұрыс сақталмауы немесе сақтау уақыты тым ұзақ, нәтижесінде жинақтағы кейбір компоненттер істен шығады.

Ұсыныс: Қатысты процедуралар үшін жаңа Buccal жағынды ДНҚ оқшаулау жинағын сатып алыңыз.

5. WB буфері абсолютті этанолды қоспайды.

Ұсыныс: WB буферінің абсолютті этанолдың дұрыс көлемін қосатынын растаңыз.

6. Элюент силикон пленкасына дұрыс қосылмаған.

Ұсыныс: Элюция тиімділігін арттыру үшін силикон мембранасының ортасына 65 °C алдын ала қыздырылған элюент тамшыларын қосып, бөлме температурасында 5 минутқа қалдырыңыз.

Төмен өнімді геномдық ДНҚ оқшауланған

Келесі ықтимал себептер келесідей:

1. Үлгілерді дұрыс сақтамау немесе тым ұзақ сақтау геномдық ДНҚ деградациясына әкеледі.

Ұсыныс: Ауызша жағындылар жаңадан алынған жақсырақ, ал консервіленген жағындыларды геномдық ДНҚ экстракциясы үшін пайдаланбау керек.

2. Егер тін үлгісінің мөлшері тым аз болса, алынған геномдық ДНҚ мазмұны аз болады.

Ұсыныс: геномдық ДНҚ экстракциясы үшін ауызша жағындыға жеткілікті жасушалар қосылуы үшін, пайдалану нұсқаулығындағы ауызша жағынды сынамаларын алу нұсқауларын орындаңыз, мүмкіндігінше көп рет сүртіңіз.

3. Foregene Protease дұрыс сақталмаған, нәтижесінде оның белсенділігі төмендейді немесе инактивацияланады.

Ұсыныс: Foregene Protease сақтау шарттарын растаңыз немесе оны ферментативті реакцияға арналған жаңа Foregene Protease-мен ауыстырыңыз.

4. Элюенттерге есептер.

Ұсыныс: Элюция үшін EB Buffer пайдаланыңыз;ddH пайдалансаңыз₂O немесе басқа элюенттер, элюаттың рН 7,0-8,5 арасында екенін растаңыз.

5. Элюат тамшылатып дұрыс қосылмаған.

Ұсыныс: силикон мембранасының ортасына элюент тамшыларын қосып, элюция тиімділігін арттыру үшін бөлме температурасында 5 минутқа қалдырыңыз.

6. Элюция сұйықтығы тым аз жиналады.

Ұсыныс: Нұсқаулықта талап етілетіндей геномдық ДНҚ элюциясы үшін элюентті пайдаланыңыз, кемінде 15 мкл.

Оқшауланған геномдық ДНҚ-ның төмен тазалығы

Төмен геномдық ДНҚ тазалығы төмен тәжірибелердің сәтсіздігіне немесе қанағаттанарлықсыз нәтижелеріне әкелуі мүмкін, мысалы: ферменттерді кесіп тастау мүмкін емес, ПТР қызығушылық танытқан ген фрагментін ала алмайды және т.б.

Ықтимал себептер келесідей:

1. Гетеропротеинді ластану, РНҚ ластануы.

Талдау: тазарту бағанасы Buffer PW көмегімен жуылмаған;Buffer PW жуу тазалау бағанасы дұрыс центрифугалық жылдамдықпен жуылмаған.

Ұсыныс: этанолды қоспас бұрын үстіңгі қабатта тұнбаның жоқтығына көз жеткізіңіз;тазалау бағанасын нұсқауларға сәйкес жууды ұмытпаңыз және бұл қадамды өткізіп жіберуге болмайды.

2. Қоспалардың иондарымен ластануы.

Талдау: буферді WB жууды тазарту бағаны бір рет қана жуылды немесе қалдық иондық ластануға әкелді.

Ұсыныс: Қалдық иондарды мүмкіндігінше кетіру үшін WB буферін 2 рет жууды ұмытпаңыз.

3. РНҚ ферментінің ластануы.

Талдау: бөгде РНҚ буферге қосылды;Буферді PW жуу әрекеті дұрыс болмады, нәтижесінде RNase қалдықтары пайда болды, бұл in vitro транскрипциясы сияқты төменгі ағындағы РНҚ тәжірибелік операцияларына әсер етті.

Ұсыныс: Foregene сериясының нуклеин қышқылын оқшаулау жинақтары РНҚ-ны қосымша RNase қоспай-ақ жоя алады, осылайша буккальды жағынды/FTA картасының ДНҚ оқшаулау жинағына RNase қосу қажет емес;Buffer PW жуу тазалау бағанына арналған нұсқауларды орындаңыз және бұл қадамды өткізіп жіберуге болмайды.

4. Этанол қалдығы.

Талдау: WB буфері тазарту бағанасын жуғаннан кейін бос түтікті центрифугалауды орындамады.

Ұсыныс: Нұсқауларға сәйкес бос түтікті дұрыс центрифугалау операциясын орындаңыз.

5. Басқа қоспалармен ластанулар.

Талдау: Сақталған үлгілер немесе арнайы үлгілер алдын ала өңделмейді.

Ұсыныс: Нұсқауларға сәйкес үлгіні алдын ала мұқият өңдеңіз.